学士学位毕业答辩

1、保加利亚乳杆菌蛋白质提保加利亚乳杆菌蛋白质提 取方法研究取方法研究 目目 录录 前前 言言 材材 料料 与与 方方 法法 结结 果果 与与 分分 析析 实实 验验 结结 论论 东北农业大学 1 2 3 4 前前 言言 东北农业大学 以裂解液为提取介质，分别采用反复冻融、超声破碎以及玻以裂解液为提取介质，分别采用反复冻融、超声破碎以及玻 璃珠破碎璃珠破碎3 3种方法提取细菌蛋白质，通过分析细菌破碎程度、蛋种方法提取细菌蛋白质，通过分析细菌破碎程度、蛋 白质白质SDS-PAGESDS-PAGE电泳及蛋白质浓度测定，比较各提取方法的效果。电泳及蛋白质浓度测定，比较各提取方法的效果。 筛选出一种稳定有

2、效的保加利亚乳杆菌的蛋白质提取方法筛选出一种稳定有效的保加利亚乳杆菌的蛋白质提取方法。 实实 验验 材材 料料 东北农业大学 菌种 设备 无菌工作台、全自动高压灭菌锅、生物显微镜无菌工作台、全自动高压灭菌锅、生物显微镜 、离、离 心机、天平心机、天平 、真空冷冻干燥机、紫外可见分光光度、真空冷冻干燥机、紫外可见分光光度 计、超声细胞破碎仪、计、超声细胞破碎仪、pHpH计、微量进样器。计、微量进样器。 试剂 十二烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、SDS-PAGE SDS-PAGE 低分子量标准蛋白、低分子量标准蛋白、- 巯基乙醇、巯基乙醇、EDTA EDTA 、丙烯酰胺、丙烯酰胺、30%30%丙烯酰胺

3、溶液、甘丙烯酰胺溶液、甘 氨酸、氨酸、MRSMRS培养基和蛋白质电泳储备液等。培养基和蛋白质电泳储备液等。 德氏乳杆菌保加利亚亚种德氏乳杆菌保加利亚亚种( (乳品科学教育部重点实验乳品科学教育部重点实验 室提供室提供) )。 实实 验验 方方 法法 东北农业大学 保加利亚乳杆菌生长曲线的建立 菌株活化、保加利亚乳杆菌生长曲线的建立 无细胞提取物的制备 l 超声破碎法：超声破碎法：将细菌沉淀加入裂解液，在冰浴中用超声波破碎仪破壁。将细菌沉淀加入裂解液，在冰浴中用超声波破碎仪破壁。 离心，得到无细胞提取物。离心，得到无细胞提取物。 l 反复冻融法：反复冻融法：将细菌沉淀加入裂解液，液氮中反复冻融后

4、，离心取上将细菌沉淀加入裂解液，液氮中反复冻融后，离心取上 清液备用。清液备用。 l 玻璃珠法玻璃珠法：将细菌沉淀加入裂解液，放入适量酸洗玻璃珠，冰浴。高：将细菌沉淀加入裂解液，放入适量酸洗玻璃珠，冰浴。高 速涡旋振荡得到无细胞提取物。速涡旋振荡得到无细胞提取物。 实实 验验 方方 法法 东北农业大学 细菌裂解程度观察 涂片晾干固定染色水洗煤染脱色复染 蛋白质定量 BCABCA试剂盒( (碧云天) )测定蛋白质浓度 , ,根据标准曲线计算出样品的蛋 白浓度。 SDS-PAGE蛋白电泳 垂直平板电泳槽的安装分离胶的制备浓缩胶的制备样品处理及 加样电泳染色及脱色 菌菌 株株 活活 化化 东北农业大

5、学 11 % (w/v) 11 % (w/v) 脱脂乳脱脂乳 培养基，培养基，3737，培养，培养36 h36 h 后，凝固，革兰氏染色镜后，凝固，革兰氏染色镜 检观察结果检观察结果( (如图如图) )，菌种，菌种 纯，活力高，可用于下步纯，活力高，可用于下步 实验。实验。 保加利亚乳杆菌生长曲线的建立保加利亚乳杆菌生长曲线的建立 东北农业大学 051015202530 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 OD600 时间(h) 保加利亚乳杆菌在保加利亚乳杆菌在MRSMRS 培养基中不同培养时间下培养基中不同培养时间下 的吸光值，并绘制其生长的吸光值，并绘制其生长

6、曲线。结果如图，保加利曲线。结果如图，保加利 亚乳杆菌在亚乳杆菌在5 h5 h左右进入对左右进入对 数生长期，在数生长期，在12 h12 h左右进左右进 入对数生长末期，入对数生长末期，16 h16 h左左 右进入稳定期。右进入稳定期。 细菌破碎程度分析细菌破碎程度分析 东北农业大学 超声破碎法处理保加 利亚乳杆菌 玻璃珠法处理保加利亚 乳杆菌 反复冻融法处理保加 利亚乳杆菌 镜下观察，玻璃珠法中细菌的破碎程度与超声破碎法相近，略低于超声破 碎法。仍有少量杆状未被充分破碎。反复冻融法中细菌破碎程度明显低于玻璃 珠法和超声法，有较多菌体仍然呈杆状未破碎，说明反复冻融法强度不够，不 能使保加利亚乳

7、杆菌充分破碎释放出蛋白质。 蛋白质标准曲线蛋白质标准曲线 东北农业大学 蛋白质质量浓度测定蛋白质质量浓度测定 东北农业大学 测定方法 超声破碎法 反复冻融法玻璃珠法 BCA试剂盒法 1.730.220.67 不同方法提取的保加利亚乳杆菌蛋白质质量浓度(g/uL) 由表可以看出，超声破碎法提取的蛋白质质量浓度最高，其次由表可以看出，超声破碎法提取的蛋白质质量浓度最高，其次 为玻璃珠法，反复冻融法提取的蛋白质质量浓度最低，进一步验证为玻璃珠法，反复冻融法提取的蛋白质质量浓度最低，进一步验证 了实验结果。了实验结果。 蛋白质SDS-PAGE图谱 东北农业大学 用超声破碎法提取的3 个平行细菌样本的蛋

8、白 质电泳图谱，由图可知， 显示3个平行样本的蛋 白质条带分部基本一致， 重复电泳3次的谱图基 本相同。 蛋白质SDS-PAGE图谱 东北农业大学 3 3种方法提取的蛋白种方法提取的蛋白 质条带分布和丰度有明显质条带分布和丰度有明显 差异，超声破碎法和玻璃差异，超声破碎法和玻璃 珠法提取蛋白质条带分布珠法提取蛋白质条带分布 基本相同，但超声破碎法基本相同，但超声破碎法 提取的蛋白质条带丰度明提取的蛋白质条带丰度明 显较高，反复冻融法均最显较高，反复冻融法均最 差。实验表明，超声破碎差。实验表明，超声破碎 法的蛋白质提取方法最好。法的蛋白质提取方法最好。 反复 冻融 玻璃珠 超声法 结结 论论

9、东北农业大学 细菌破碎程度细菌破碎程度 提取蛋白质质量浓度提取蛋白质质量浓度 蛋白质蛋白质SDS-PAGESDS-PAGE结果结果 前前 言言 东北农业大学 以裂解液为提取介质，分别采用反复冻融、超声破碎以及玻以裂解液为提取介质，分别采用反复冻融、超声破碎以及玻 璃珠破碎璃珠破碎3 3种方法提取细菌蛋白质，通过分析细菌破碎程度、蛋种方法提取细菌蛋白质，通过分析细菌破碎程度、蛋 白质白质SDS-PAGESDS-PAGE电泳及蛋白质浓度测定，比较各提取方法的效果。电泳及蛋白质浓度测定，比较各提取方法的效果。 筛选出一种稳定有效的保加利亚乳杆菌的蛋白质提取方法筛选出一种稳定有效的保加利亚乳杆菌的蛋白

10、质提取方法。 实实 验验 方方 法法 东北农业大学 保加利亚乳杆菌生长曲线的建立 菌株活化、保加利亚乳杆菌生长曲线的建立 无细胞提取物的制备 l 超声破碎法：超声破碎法：将细菌沉淀加入裂解液，在冰浴中用超声波破碎仪破壁。将细菌沉淀加入裂解液，在冰浴中用超声波破碎仪破壁。 离心，得到无细胞提取物。离心，得到无细胞提取物。 l 反复冻融法：反复冻融法：将细菌沉淀加入裂解液，液氮中反复冻融后，离心取上将细菌沉淀加入裂解液，液氮中反复冻融后，离心取上 清液备用。清液备用。 l 玻璃珠法玻璃珠法：将细菌沉淀加入裂解液，放入适量酸洗玻璃珠，冰浴。高：将细菌沉淀加入裂解液，放入适量酸洗玻璃珠，冰浴。高 速涡旋振荡得到无细胞提取物。速涡旋振荡得到无细胞提取物。 细菌破碎程度分析细菌破碎程度分析 东北农业大学 超声破碎法处理保加