基因工程实验_biochemlab[优制材料]

1、基因工程实验基因工程实验 1行业材料 实验目录 实验一 实验计划表 实验二 染色体DNA的提取 实验三 PCR扩增 实验四 凝胶电泳法回收目的DNA及其体外连接 实验五 感受态细胞的制备 实验六 重组质粒的转化 实验七 质粒的提取 实验八 重组质粒的酶切鉴定 2行业材料 实验一 实验计划表 、了解本学期整体的实验流程及安排。、了解本学期整体的实验流程及安排。 、熟练使用微量移液器。、熟练使用微量移液器。 、学习制备琼脂糖凝胶。、学习制备琼脂糖凝胶。 3行业材料 v 基因工程（Gene Engineering）又称重组技术，把不 同生物的与载体相连，并导入到受体细胞中去增殖、表 达。 v 基因工

2、程包括切、接、转、增、检五大要素。 4行业材料 凝胶电泳系统、微量移液器、三角瓶、微波炉、铲子、 手套 琼脂糖、1TBE、加样缓冲液 5行业材料 目的基因的获取 基因组总提取凝胶电泳检测 扩增目的基因 产物的电泳检测 产物纯化获得目的基因 1.本学期实验计划 6行业材料 重组、转化 与pMD18-T连接DH5a感受态细胞制备 转化、平板涂布、培养 筛选与鉴定 抗生素抗性筛选挑单菌落培养提取质粒质 粒酶切、电泳检测 7行业材料 2.微量移液器的使用 将微量移液器按钮轻轻压在第一挡 垂直握持微量移液器，使吸头浸入页面下几毫米，千万别将吸头 直接插到液体底部 缓慢、平稳地松开控制按钮，吸上样品液。否

3、则液体进入吸头太 快，导致液体倒吸入移液枪内部，或吸入体积减少。 等1s后将吸头提高液面，并使吸头在容器壁擦过 平稳把按钮压到第一停点，在把按钮压到第二停点以排出剩余液 体、 提起微量移液器，使吸头在容器壁擦过 然后按吸头弹射器除去吸头 使用操作 8行业材料 使用注意事项 未装吸头的微量移液器绝对不可用来吸取任何液体。 一定要再允许范围内设定容量，千万不要将读数的调 节超出其适用的刻度范围，否则会造成损坏。 不要横放带有残留液体吸头的移液器 不要用大量程的移液器移取小体积样品 微量移液器每日用完后，应旋转到最大刻度，让弹簧 恢复原形，保持弹性。 为了确保微量移液器的准确性，移液器必须定期进行

4、校准。 9行业材料 3. 琼脂糖凝胶制作 选择好胶盒、胶板和梳子，洗净，把胶板放入胶盒中， 梳子插上。 量取25ml 1TBE溶液放入锥形瓶或烧杯中 称量0.25g 琼脂糖，倒入锥形瓶中 将锥形瓶放入微波炉中，让溶液沸腾2-3次，琼脂糖彻 底融化 锥形瓶取出，稍稍冷却后倒入胶盒中 等待琼脂糖冷却凝固形成点样孔后即可 10行业材料 掌握酚氯仿法提取的原理和操作。掌握酚氯仿法提取的原理和操作。 11行业材料 生物的大部分或几乎全部都集中在细胞核或类 核中。DNA在体内通常都与蛋白质结合，蛋白质对 DNA制品的污染常影响到以后的DNA操作过程，因此 需把蛋白质除去，一般采用酚氯仿抽提法。苯酚、氯 仿

5、对蛋白质有极强的变性作用，而对DNA无影响。经 苯酚、氯仿抽提后，蛋白质变性而被离心沉降到酚相 与水相的界面，DNA则留在水相，少量的或与DNA紧 密结合的蛋白质可用蛋白酶予以去除。DNA制品中少 量的RNA无影响，必要时可加入不含DNase的 RNase去除RNA污染。 12行业材料 消化缓冲液: TE 、EDTA、 NaCl、 SDS、蛋白酶K Tris平衡酚、氯仿:异戊醇(24:1)，NaAc，无水乙醇， 70%乙醇 微量移液器、高速离心机、1.5ml管、吸头、烘箱、 水浴锅、1.5ml管架、胶头滴管、冰箱 13行业材料 、切取组织 ，剪碎放入研钵(越细越好)，磨成粉末。 以消化缓冲液处

6、理55水浴过夜，获得组织消化液。 、取出消化组织液，5000rpm ，min，取上清液 于新离心管 。 、 加等体积ris-平衡酚，轻轻混匀min。 4、1000rpm，10min，留上清，取上清液于新离心 管 。 、加等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提，轻轻混 匀min。 、同。 、加等体积氯仿:异戊醇，轻轻混匀min。 、同。 14行业材料 、加 1/10 体积3mol/L NaAc，及. 倍体 积预冷（）无水乙醇，混匀。 沉淀min。 、12000rpm，15min，弃上清。 、加70%乙醇1ml，混匀。 、 同。 、管放置于烘箱中烘干。 、加ul TE或ddH2O溶解。 、琼

7、脂糖凝胶电泳检测。 15行业材料 提取染色体的基本原理是什么？操作中 应该注意什么？ 16行业材料 、学习扩增的基本原理。、学习扩增的基本原理。 、掌握技术的常规操作。、掌握技术的常规操作。 、了解扩增的参数设计。、了解扩增的参数设计。 实验三实验三扩增扩增 17行业材料 、聚合酶链反应 (Polymerase chain reaction， PCR)：利用核酸变、复性的性质，以待扩增的 为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异片 段的过程。 、反应体系 引物、dNTP、 Mg 、模板、 Taq DNA聚合酶， Buffer。 18行业材料 、循环参数 9 5min 9 30s 5 30s 72

8、 30s goto times 72 10min 19行业材料 Taq DNA聚合酶，PCR缓冲液， MgCl2，dNTP，引物，模板， ddH2O，TBE电泳缓冲液，EB,加样缓冲液 旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头， 0.2ml PCR微量离心管，PCR仪，台式离心机， 琼脂糖凝胶电泳系统，紫外凝胶成像系统 20行业材料 、在0.2ml PCR 微量离心管中配制30ul反应体系。 dd water 20.5ul 10PCR buffer（不含MgCl2） 3ul 25mM MgCl2 2ul 10mmol/L dNTP 1ul 10mol/L Primer 1 1ul 10mol/L

9、 primer 2 1ul 模板 1ul Taq酶 0.5ul 总体积 30ul 21行业材料 、在离心机中混匀。 、管放入仪中，按照原理中的条件设置程 序，进行反应。 、PCR结束后，取3ul PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳 检测。 22行业材料 PCR中产生非特异性条带的原因可能有哪些？ 23行业材料 实验四 凝胶电泳法回收目的 DNA及其体外连接 24行业材料 1. 学习和掌握从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法。 2. 掌握DNA体外连接的方法。 25行业材料 1.DNA分子在琼脂糖凝胶中的电泳速率与以下因素有 关 DNA分子大小 DNA分子构象 琼脂糖凝胶浓度 电泳所用电压 电泳缓冲液

10、26行业材料 2. 利用硅胶膜在高盐浓度时能特异性吸附DNA，而在低 盐浓度时可使DNA被洗脱的原理纯化DNA。 3. Taq酶参与PCR反应中，产物双链核酸中的3端各多 连接一个脱氧腺苷酸A，与商业开发的pMD18-T载体 可在DNA连接酶作用下，按照碱基配对形成环状的完 整质粒。 27行业材料 凝胶电泳系统，刀片，紫外仪，酒精灯 1.5ml EP管，1.5ml EP管架，65 水浴锅 PCR产物，1TBE，加样缓冲液，TakaRa胶回收试 剂盒，TA克隆试剂盒，DL2000 marker 28行业材料 1. 2%琼脂糖凝胶电泳 2. 在紫外灯下用干净的手术刀割下含有目的DNA琼脂糖块 装在

11、1.5ml的EP管中称量减1克即为凝胶块重量 3. 加入5个凝胶体积量的DR- Buffer 4. 混匀 65加热融化凝胶块 5. 加入DR-Buffer量的1/2 体积的DR- Buffer, 当目 的片段小于400bp再加入终浓度为20% 的异丙醇 6. 将上述溶液short后转移至spin coloumn中12000rpm, 1min 弃滤液 7. 加入500ul RinseA 12000rpm 30s 弃滤液 8. 加入700ul RinseB 12000rpm 30s弃滤液 9. 同8 29行业材料 10. 将spin coloumn安置于新的1.5ml EP管中 在spin col

12、oumn膜中央加25ulElution Buffer 放入烘箱1min 12000rpm 1min 保存1.5ml EP管1%胶检测 11. 链接反应（冰上操作） 在一支0.2 ml EP管中加入以下试剂： 纯化的目的DNA片段 4.5ul Vector 0.5ul 连接液 5ul 混匀 16连接过夜 30行业材料 为什么连接反应的温度要定在16度？ 31行业材料 实验五 感受态细胞的制备 1.掌握感受态细胞的制备方法 2. 学习和理解影响细胞感受态的因素 32行业材料 感受态是指受体（或者宿主）细胞最易接受外源 DNA片段并实现其转化的一种生理状态，它是有受体菌 的遗传性所决定的。转化过程中

13、所用的受体细胞一般 是限制修饰系统缺陷的变异株，既不含限制性内切 酶和甲基化酶的突变株。用Cacl2处理受体细胞，使细 胞的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞。 33行业材料 培养皿，离心管，冷冻高速离心机，超低温冰箱，摇 床，锥形瓶 Cacl2， LB Amp-液体培养基， LB Amp-固体培养基， DH5甘油菌 34行业材料 1.先从保存菌种DH52(-70),划线培16h(37) 2.从平板中挑取一个单菌落移到4ml，LB Amp- 培养基中，37摇荡过夜180250rpm 3.按1%的接种量将过夜培养的菌转接于50ml LB Amp-的培养 基中，3

14、7，250rpm（2h2.5h） 4.当培养菌生长至OD600达0.50.6时（约22.5h），将培养 菌取出，在无菌条件下将细菌转移至50ml无菌聚乙烯离心 管中，冰浴10min，以使培养液冷至0 35行业材料 5.4，5000rpm/min,7min 6.细胞沉淀用10ml冰冷的Cacl2溶液重悬于4，5000rpm/min， 5min 7.细胞沉淀用10ml冰冷的Cacl2溶液重悬冰上放置30min， 于 4，5000rpm/min，5min 8.用2ml冰冷Cacl2溶液重悬各管细胞，然后按每管100ul的量 分装于预冷的0.5ml EP管中存于-70 36行业材料 如果实验对照组本不

15、该长菌落的平板上长出了一些菌 落，你将如何解释这种想象？ 37行业材料 实验六 重组质粒的转化 掌握重组质粒的转化方法 38行业材料 1.转化是将外源DNA 分子引入受体细胞，使之获得新的 遗传性状的一种手段。 2.化学转化法 利用Cacl2处理感受态受体细胞，然后通过热休克 处理，即置于42高温热激90s，热休克后，是受体菌 在不含抗生素的培养液中生长至少半小时以上，使其 表达足够蛋白质，以便能在含抗生素的平板上生长菌 落。 39行业材料 水浴锅，培养箱，枪头，冰盒，超净台，微量加样器， 制冰机，牙签 DH5感受态细胞，连接产物，LB Amp-液体培养基， LB Amp+液体培养基，LB A

16、mp+ 培养基平板 40行业材料 1.5ul连接液加100ul感受态细胞（-70取出），置冰上，加后轻轻旋动 2.冰上静置30min 3.42水浴90s热休克，冰上3min 4.加10ul LB （Amp-）至菌液，混匀（颠倒） 5.37烘箱30min 6.37，摇床 30min 180rpm 7.涂平板 100ul/板， 37培养1216h 8.挑克隆 挑取菌落接入5ml LB Amp+液体培养基中，37 振荡过夜 41行业材料 当质粒加入宿主细胞进行转化，再涂布在含有Amp的LB 培养基平板前，为什么要在LB培养基中培养1h? 42行业材料 实验七 质粒的提取 1.学习质粒DNA提取的基本

17、原理 2.掌握质粒最常用提取方法 43行业材料 细菌质粒DNA的提取是根据环状质粒DNA分子具有相对 分子质量较小、易于复性的特点进行的，碱法是常用 的提取方法。在热或碱性条件下DNA分子双链解开，若 此时将溶液置于复性条件，由于变性的质粒分子能在 较短的时间内复性而染色体DNA不能复性，从而分离质 粒DNA。 44行业材料 高速离心机、微量移液器、枪头、凝胶电泳系统，凝胶 紫外成像系统，EP管 EB，加样缓冲液，阳性克隆的培养液，质粒提取试剂盒 45行业材料 1. 取14ml过夜培养的阳性克隆菌液，12000rpm离心 2min,弃上清 2.用250ul的solution(含RNaseA1)

18、充分悬浮细菌沉淀 3.加入250ul的solution轻轻上下翻转混合56次使菌 体充分裂解，形成透明溶液 4.加入400ul的4 预冷的solution，轻轻上下翻转混 合56次，直至形成紧实凝集块，室温静置2min 46行业材料 5.室温12000rpm， 10min，取上清 6.将试剂盒中的Spin column安置于collection Tube上 7.将操作6中的上清液转移至Spin column中12000rpm， 1min，弃滤液 8.将500ul的RinseA加入Spin column中， 12000rpm，30s， 弃滤液 9.加700ul的RinseB加入Spin colu

19、mn中， 12000rpm，30s， 弃滤液 10.同9 47行业材料 11.将Spin column安置于新的1.5ml离心管上,在Spin column膜中央处加入60ul灭菌或Elution Buffer,室温 静置1min 12. 12000rpm， 1min洗脱DNA 13.凝胶电泳检测提取效果，并以空载体做对照，从质粒 大小上初步判断是否有外源基因进入载体 48行业材料 在碱法提取质粒DNA操作过程中应该注意哪些问题？ 49行业材料 实验八 重组质粒的酶切鉴定 1.学习和掌握限制性内切酶的特性 2.了解重组质粒的鉴定方法，重点掌握重组质 粒的酶切鉴定方法 50行业材料 1.限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性 核酸