分子生物学常用的各种技术项目举例

1、分子生物学常用技术分子生物学常用技术 3.1 凝胶电泳技术 3.2 分子杂交技术 3.3 PCR技术 3.4 3.5 基因文库构建 3.6 DNA测序 凝胶电泳(Gel electrophoresis)是分子克隆的中心 技术之一。 1. 琼脂糖凝胶用于分离2001000bp的片段； 操作简单、快速，且分离范围广，分辨率高 2. 聚丙烯酰胺凝胶用于分离5500bp的片段； 效果好、分辨率极高，相差1bp的DNA片断就 能分开，能容纳相对大量的DNA 用于DNA测序；核苷酸多态性的分析 3.1 凝胶电泳技术 3.1 凝胶电泳技术 3.1.1 琼脂糖凝胶电泳的原理 3.1.2 琼脂糖凝胶电泳的影响因

2、素 3.1.3 琼脂糖凝胶电泳的应用 琼脂糖 Agarose 主要从海洋植物琼脂中提取来 的，为一种聚合线性多糖分子。琼脂糖溶液冷却 形成的琼脂糖凝胶 Agarose gel呈网状结构，具有 分子筛效用，可作为DNA电泳介质。琼脂糖凝胶 的孔径取决于琼脂糖的浓度。 经化学修饰后熔点降低的琼脂糖叫低熔点琼脂 糖 Low melting point agarose ，其机械强度无明显 变化，但可被agarase水解。主要用于胶中DNA的 直接酶促反应。 3.1.1 琼脂糖凝胶电泳的原理 3.1.1 琼脂糖凝胶电泳的原理 核酸是带均匀负电荷的生物大分子，在电场中 向正极移动，不同大小和构象的核酸分子

3、的电荷 密度大致相同，在自由泳动时，各核酸分子的迁 移率区别很小，难以分开。 以适当浓度的凝胶作为电泳支持介质，其分 子筛效应使得大小和构象不同的核酸分子泳动率 出现较大差异，达到分离的目的。此为分离、鉴 定、纯化核酸片段的标准方法。 用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭（EB）对 DNA 染色，在紫外光下激发红色荧光，可直接确 定DNA在凝胶中的位置。 凝胶电泳原理-凝胶阻滞 在凝胶电泳后，用适量溴化乙锭(ethidium bromide，简称EB)染料对核酸分子进行染色， EB能 插入到DNA或RNA分子的相邻碱基之间，并在300nm 波长的紫外光照射下激发出红色荧光。在适当的染 色条件下，荧光

4、强度与DNA片段的数量成正比。 可直接观察，即将电泳胶放置在紫外光下观察记 录电泳图像。检测灵敏快捷，0.05g的微量DNA可 以清晰地检测出来。 把EB直接加到凝胶介质中，染料便会与DNA分子 结合，却不能与凝胶相结合。这样就只有DNA分子 能吸收EB并发出荧光。但长期不能被降解，污染环 境。 溴化乙锭（EB）为致癌剂，操作时应戴手套，尽 量减少台面污染。 凝胶电泳原理-EB染色 核酸电泳的指示剂 核酸电泳常用的指示剂有两种： 溴酚蓝 二甲苯青， 溴酚蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色； 二甲苯晴（xylene cyanol, Xc）呈蓝青色，它 携带的电荷量比溴酚蓝少，

5、在凝胶中的的迁移 率比溴酚蓝慢。 3.1.2 琼脂糖凝胶电泳的影响因素 1核酸的性质 DNA分子的大小，构象 2凝胶孔径的大小 凝胶浓度 3电场强度和电场方向 电极，电压，电流 4缓冲液 缓冲液组成和离子强度 不同浓度琼脂糖的凝胶最适分离范围 琼脂糖浓度（，W/ V ) DNA分子的有效分离范围（kb) 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-3 2.0 0.1-2 水平式琼脂糖凝胶电泳仪 a DNA分子迁移速率U与logN成反比（N为碱基对数目）。分子大小相等，电荷 基本相等（DNA结构重复性）。分子越大，迁移越慢。等量的空间结构紧密 的电泳快（超螺旋线

6、性DNA）。 b 琼脂糖浓度：logU=logU0 Kr 胶浓度，U为迁移率，U0 为DNA的自由电泳迁移 率，为胶浓度，Kr为介质阻滞系数。不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA Agarose：0.5%： 1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb 1.2%： 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb。 c DNA构象：一般迁移速率超螺旋环状线状DNA单链开环。当条件变化时， 情况会相反，还与琼脂糖的浓度、电流强度、离子强度及EB含量有关。 d 所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。使分辨 效果好，凝胶上所加电压不应超过5V/cm。 e 碱基组成与温度：

7、一般影响不大，4 -30 。 f 嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率，(不提倡加在电泳液中)。 g 电泳缓冲液 （0.5TBE）的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离子存 在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔化凝胶并导致DNA变性， 一般采用1TAE，0.5TBE，1TPE（均含EDTA pH8.0）。 影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素 3.1.3 琼脂糖凝胶电泳的应用 琼脂糖凝胶电泳应用PCR产物检测 琼脂糖凝胶电泳应用酶切产物电泳检测 琼脂糖凝胶电泳应用RFLP分析 琼脂糖凝胶电泳应用核小体DNA分析 琼脂糖凝胶电泳应用凋亡细胞DNA分析 琼脂糖凝胶电泳应用凝胶阻滞分

8、析 琼脂糖凝胶电泳应用凝胶足迹法分析 琼脂糖凝胶电泳应用DNA印迹电泳 琼脂糖凝胶电泳应用正交场脉冲电泳 琼脂糖凝胶电泳应用PCR产物检测 琼脂糖凝胶电泳的应用酶切产物电泳检测 琼脂糖凝胶电泳的应用RFLP分析 琼脂糖凝胶电泳的应用核小体DNA分析 琼脂糖凝胶电泳的应用凋亡细胞DNA 琼脂糖凝胶电泳的应用凝胶阻滞分析 Gel retardation analysis 琼脂糖凝胶电泳的应用 凝胶足迹法分析 琼脂糖凝胶电泳的应用DNA印迹电泳 琼脂糖凝胶电泳的应用正交场脉冲电泳 基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的 是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因 此必须用对RNA酶有抑制作用D

9、EPC水来配置所有 溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处 理以尽量减少RNA酶对样品的降解； 另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响 其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行， 常用的变性剂为甲醛和戊二醛。 RNA 电 泳 RNA甲醛变性凝胶电泳图像 核酸分子杂交基本原理 DNA-DNA 杂交双链分子 变性 复性 不同来源的 DNA分子 复性 RNADNA 4. （ 32 克隆DNA序列检测 菌落噬菌斑原位杂交法 杂交探针的标记：ABC荧光标记 GCTTGAGCAGTAACCTG 荧光胺 Biotin 生物素 Avidin 生物素结合蛋白 烷烃连接臂 克隆DNA序列检测 菌落噬菌斑原位杂交法 杂交探针的标记：ABC显色酶标记 GCTTGAGCAGTAACCTG 显色酶 Biotin 生物素 Avidin 生物素结合蛋白 烷烃连接臂 生色底物 颜色产物 克隆DNA序列检测 菌落噬菌斑原位杂交法 杂交探针的标记：地高辛系统标记 dUTP-连接臂-甾醇半抗原 digoxigenin DIG 抗体-显色酶交联复合物 分子杂交实验 目 录 目 录 鸡的肌球蛋白的克隆和检出 DNA印迹杂交 Northern印迹杂交实验流程 同一基因 Southern Northern Western 印