反硝化菌株TGR30的特征

1、反硝化菌株TGR30的特征随着农业经济的迅速发展，灌溉而积和灌溉用水量不断增加，化 肥施用量也不断增加，由于灌溉技术落后和化肥的有效利用率较低, 农田灌溉退水污染成为亟待解决的问题（曹仁林和贾晓葵，2001）o宁 蒙灌区地处黄河中上游，年退水30亿m3,主要污染物为氮、磷和 COD,其中造成超标污染物主要为氮（张爱平等，2008）,对灌区水环 境和黄河水安全构成了严重影响。人工湿地利用基质-微生物-植物这个复合生态系统，具有独特而复 杂的净化机理（潘丽娟和阳小成，2008）,与传统的污水处理法相比具 有基建、运行费用低，操作与维护简单等优点（梁继东等，2003）。微 生物在人工湿地氮素的去除过

2、程中发挥着关键作用，张列宇等（2010） 认为，氨化-亚硝化-硝化-反硝化是湿地中脱氮的最主要途径。反硝化 细菌的反硝化反应则是使硝酸盐氮重新回到大气的主要途径（方芳和 陈少华，2010）,因此高效反硝化细菌的获得对人工湿地的构建，解 决农灌退水污染具有重要意义。研究表明，好氧反硝化细菌克服了传统的反硝化细菌只能在缺氧 条件下进行反硝化作用的缺点，有氧生长，生长周期短，对高浓度的 氮耐受力很强（Jooetal., 2005;周立祥等，2006）,好氧反硝化细菌的 发现，为生物脱氮技术注入了新的活力。但是现在发现的好氧反硝化 细菌为数不多（Patureauetal., 2000;黄运红等，200

3、7;王弘宇等，2007）, 而高效的好氧反硝化细菌则更少（朱晓宇等，2009）o已发现的菌株中 假单胞菌属最为常见（李卫芬等，2011）,关于芽泡杆菌属的报道相对 较少。木研究涉及的人工湿地示范基地建在内蒙古自治区巴彦淖尔市 乌拉特前旗境内，所在环境条件恶劣，盐碱化程度较高，有关能够适 应此环境的高效好氧反硝化芽泡杆菌的研究鲜见报道。因此，本研究在天然湿地底泥中分离出高效好氧反硝化芽泡杆菌, 对其进行生物学鉴定，确定其在分类学上的地位，并在实验室条件下 对细菌反硝化特性进行系统的研究，充分认识湿地系统优势好氧脱氮 芽泡杆菌的脱氮特性，为今后工程实践及强化微生物脱氮技术提供参 考。1材料与方法1

4、.1样品来源2010年6月采自内蒙古巴彦淖尔市乌梁素海底泥，风干，保存于 纸袋中。1.2培养基菌株分离培养基(NA):牛肉膏3.0g,蛋口腺lO.Og, NaCI5.0g,琼脂 20.0g, pH7.27.4,蒸憎水lOOOmLo硝酸盐还原产气培养基:牛肉膏 3.0g,蛋白月东 lO.Og, KNO31.0g, pH7.27.4,蒸馅水 lOOOmLo 种子 培养基:葡萄糖 lO.Og, CaCI2O.2g, MgSO47H2O0.5g, (NH4)2SO42.0g, KCIO.2g,乙酸钠3.32g, pH7.27.4,蒸憾水lOOOmLo反硝化基础培 养基:KNO32g, MgSO47H2

5、O2g, KH2PO40.5g,葡萄糖 lOg, pH7.2 7.4,蒸憎水lOOOmLo菌株生理生化鉴定培养基参照文献的方法(东秀 珠和蔡妙英，2001)。1.3芽泡杆菌的分离称取lg样品放入装有9mL无菌水的试管中，80回水浴20min,充 分振荡混匀，取lmL到下一个同样的试管中，依次稀释得到各种浓 度的菌悬液。分别取10 510-73个稀释梯度的稀释液O.lmL涂布 于NA平板上，然后倒置于370培养箱中培养24h。挑取不同形态的 单菌落转接至NA斜而上，37囚恒温培养24h,置于4固冰箱保存备用。 所挑取菌落同时在NA培养基平板上划线检验纯度。1.4 R硝化芽泡杆菌的筛选将1.3分离

6、得到的菌株进行硝酸盐还原试验，具体方法参照文献(东秀珠和蔡妙英，2001)o对于能利用硝酸盐并且产气的试验菌株接 种到反硝化基础培养基，370, 200rmin-l,摇床震荡培养，离心取 上清，测定总氮含量。根据氮含量的变化进一步确定优势菌株。总氮 的测定采用过硫酸钾氧化紫外分光光度法(魏复盛等，2002)o1.5菌株TGR30的鉴定1.5.1形态与生理生化鉴定菌株的形态学鉴定与生理生化鉴定参照常见细菌系统鉴定手册(东秀珠和蔡妙英,2001) 进行。1.5.2基因组DNA的提取及16SrDNA鉴定参考Kim等(1995)和Rainey等(1996)的方法提取细菌基因组DNA, 以琼脂糖凝胶电泳

7、检测DNA质量。扩增引物为通用引物(Claudiaetal.,2002) , 正向引物 27F:5/-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3,;反向引物 1492R:5,-GGTTACCTTGTTACGACTT-3,o PCR 反应体系、扩增程序以及产 物的检测参照胡朝松等(2009)方法。纯化后的PCR产物送宝瑞通生物 技术(北京)有限公司测序分析。将测序结果用BLAST软件与GenBank 中己登录的16SrRNA基因序列进行同源性比较，通过CLUSTALX和 BIOEDIT等软件进行多重序列比对分析，并以Neighbor-joining法构建 系统发育树(Sai-tou&Nei,

8、1987)。1.6反硝化细菌TGR30的反硝化特性测定方法1.6.1碳源主要考察醋酸钠、洒石酸钾钠、葡萄糖、蔗糖、柠檬酸三钠、可 溶性淀粉、琥珀酸钠、甘露醇、麦芽糖、乳糖对菌株反硝化特性的影 响。将不同碳源分别以2%的添加量代替反硝化基础培养基中的葡萄 糖，同时有不加碳源的培养基作对照。将试验菌株经纯培养18h后按 8%的接种量加入到添加不同碳源的发酵培养基中，37(21, 200rmin- 1摇床振荡培养66h后取样测定总氮含量。1.6.2碳氮比试验中C/N均以碳源与氮源的质量比计算。反硝化基础培养基中 KN03浓度始终为2g*L-l,添加1.6.1小节中的最优碳源，碳源添加 量根据试验调整，其他成分不变。菌株培养方法以及取样测定方法