DNA重组实验步骤

1、DNA 重组实验步骤要求： 1 每个同学需要的 3 张照片参见黄色字体。2 写实验报告的时候请将相应的试剂盒的实验步骤写入， 本文仅作参考， 不能照抄。 试 剂盒的说明书在实验室桌子上都有。第一组：目的基因： GAPDH 甘油醛 -3-磷酸脱氢酶 ：片段大小： 496bp第二组：目的基因： Actin 肌动蛋白 ，片段大小 ：约 200bp1.总 RNA 的抽提 （参照植物组织 RNA 提取试剂盒， 本部分直接以提供材料开始， 可以 不写）所取材料经 DEPC 水（蚕体或组织）清洗后，添加液氮充分研磨；然后转入 1.5 mLEppe ndof 管，加入 1 mL TRIzol ,振荡 2 mi

2、n ,室温静置 5 min ; 4 C, 12 000 r/mi n 离心 5 min , 上清转入新的 Eppendorf 管中；以每毫升 TRIzol 0.2 mL 氯仿的比例加入氯仿，振荡 15 s 左 右，室温放置5 min , 12 000 g, 4 C离心15 min ;取上清液，加 0.6 mL异戊醇，颠倒混匀， 静置10 min ； 4 C，12 000 g离心10 min，弃上清；加入 1 mL用DEPC水配置的75%乙醇 洗RNA沉淀，室温晾干；将沉淀溶于50丄DEPC水中，-70 C保存备用。2RNA 反转录 （参照 RT-PCR 试剂盒 ）在 Eppendof 管中加入

3、组织总 RNA 1 讥，Oligo （dT）化 1 卩,40 U/ 卩 L RNase Inhibitor 0.5 讥，5 x reactionbuffer 4 卩 L, 2.5 mmol/L dNTP 2 卩 L,200 U/ 卩 LRTase M-MLV 1 卩 L,然后加 DEPC水至20 y；42C水浴1 h,然后70C灭活10 min,此即为第一链 cDNA产物。3 .PCR 扩增反应程序及加样体系（参照 RT-PCR 试剂盒 ）PCR扩增反应程序（上海生工试剂）：94C预变性3 min , 94C 50 s , 55C（根据引物适当改变） 50 s, 72C 50 s, 30个循环

4、。终延伸 72C 10 min。ddH2O16.310 XPCR Buffer,2+、(without Mg )2.525 mmol/L MgCl 22.01L2.5 mmol/L dNTPmix1.01LPrimer-s1.01 L(约20 pmol/L )Primer-a1.01 L(约20 pmol/L )cDNA1.01 L(约2.0 ng)Taq DNA聚合酶0.21 L(约1.0 U)总体积25.01L1.2% Agarose凝胶电泳，记录拍照结果。4 PCR产物的回收与连接DNA回收参照天根 Agarose Gel DNA Purification Kit使用说明书。连接：在微型

5、离心管中依次加入纯化PCR产物8 U (目的基因)，pUC19 2让，buffer 4ul,dNPT 1ul, T4连接酶1ul,水4ul,共20ul体系。11度20分钟后70度5分钟即可。5感受态细胞制备挑取大肠杆菌DH5A划线培养得到的单菌落；挑单菌落接种于3 mL LB液体培养基过夜培养，然后取30丄菌液接种于3 mL LB液体培养基，37 C 200 r/min震荡培养至OD550 达0.5左右(液体变浑浊即可);将培养液转入1.5 mL离心管，冰浴10 min ; 4 C, 3500 r/min 离心5 min，弃上清；用预冷的 75 mmol/L CaCl 2 750 L轻轻悬浮细

6、胞，冰浴 30 min ; 4 C, 3500 r/min离心10 min，弃上清；加入 200 L预冷的75 mmol/L CaCl 2轻轻悬浮细胞，冰浴 4 h以上，即成感受态细胞。6 .连接产物的转化取200 U感受态细胞悬液，加入连接产物10 uL，轻轻混匀，冰浴 30 min ; 42C水浴1min ,立即置于冰浴中2-3 min ,然后向离心管中加入 1 mL 37 C预热LB培养基，于37C 200 r/min振荡培养1 h,使细胞恢复正常生长状态；4C, 3500 r/min离心5min ,弃900 L上清，加入5 L X-gal(20 mg/mL)和5丄IPTG (100 mg/mL ),轻轻悬浮细胞，将菌液均匀涂布在 含Amp+抗生素的LB固体培养基上；正面放置 1 h使吸收完全，然后 37C倒置培养过夜。7.重组质粒的筛选观察蓝白斑结果（拍照记录，培养皿上有自己的名字，没有的本次实验重做），挑取单个独立的白色菌落（可将培养基平板放置 4C冰箱显色），分别接种于3 mL含有相应抗生 素的LB液体培养基上，37 200 r/min震荡培养过夜。8质粒DNA抽提（参照试剂盒）质粒DNA小量制备试剂盒。9酶切反应在1.5mL的Eppe ndof管中依次加入dd