酶的分离与纯化课件

1、1 第四章第四章 酶的分离与纯化酶的分离与纯化 一、酶的分离一、酶的分离 二、酶的精制二、酶的精制 三、电泳三、电泳 四、酶的浓缩四、酶的浓缩 五、酶结晶五、酶结晶 2 3 一般程序一般程序 1. 1. 预处理和固液分离：加速固液相分离预处理和固液分离：加速固液相分离 2. 2. 细胞破碎分离胞内产物细胞破碎分离胞内产物 3. 3. 初步纯化（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质初步纯化（提取）：除去与目的产物性质差异很大的杂质 4. 4. 高度纯化（精致）：除去与产物性质相似的杂质高度纯化（精致）：除去与产物性质相似的杂质 5. 5. 产品加工产品加工 4 一、酶的分离一、酶的分离 （一

2、）发酵液预处理（一）发酵液预处理 目的：目的： 改变发酵液物理性质改变发酵液物理性质 尽可能使产物转入便于后处理的某一相中尽可能使产物转入便于后处理的某一相中 去除部分杂质去除部分杂质 5 1 1、发酵液的相对纯化、发酵液的相对纯化 （1 1）无机离子的去除）无机离子的去除 Ca2+ 常用草酸 常用草酸 Mg2+ 三聚磷酸钠，生成可溶性络合物 三聚磷酸钠，生成可溶性络合物 Na5P3O10+Mg2+ =MgNa3P3O10+2Na+ Fe3+ 黄血盐 黄血盐K4Fe(CN)6, ,形成普鲁形成普鲁(Fe4Fe(CN)63)沉淀沉淀 3K4Fe(CN)6+4Fe3+=Fe4Fe(CN)63+12

3、K+ 6 (2)(2)杂蛋白质的去除杂蛋白质的去除 1 1）沉淀法）沉淀法 机理主要是破坏电荷。酸性溶液中与一些阴离机理主要是破坏电荷。酸性溶液中与一些阴离 子如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸等形成沉淀。碱性溶液中子如三氯乙酸、水杨酸、苦味酸等形成沉淀。碱性溶液中 与一些阳离子如与一些阳离子如Ag2+ Cu2+ Zn2+ Fe3+ Pb2+等形成沉淀等形成沉淀 2 2）变性法）变性法 蛋白质因变性导致溶解度下降而被除去。常见蛋白质因变性导致溶解度下降而被除去。常见 的如加热、大幅度调的如加热、大幅度调pHpH、加有机溶剂和表面活性剂等。加有机溶剂和表面活性剂等。 3 3）凝聚和絮凝）凝聚和絮凝 用用

4、Al2(SO4)3等凝聚剂使蛋白质胶体体系不稳定，通过相互等凝聚剂使蛋白质胶体体系不稳定，通过相互 碰撞发生凝集。形成的颗粒较细。碰撞发生凝集。形成的颗粒较细。 絮凝作用是指在某些高分子絮凝剂（如聚丙烯酰胺类衍生絮凝作用是指在某些高分子絮凝剂（如聚丙烯酰胺类衍生 物）的架桥作用下将胶体粒子交联成网，形成物）的架桥作用下将胶体粒子交联成网，形成1010mmmm大小絮大小絮 凝团的过程。形成的颗粒较粗，用量小，速度快。凝团的过程。形成的颗粒较粗，用量小，速度快。 4) 4) 吸附法吸附法 7 (3)(3)色素及其他物质的去除色素及其他物质的去除 活性炭：活性炭：0.1-1.5%0.1-1.5% 离

5、子交换树脂离子交换树脂 如如DEAE-DEAE-纤维素从含酶溶剂中吸附色素物质时，可同时去除非活性蛋纤维素从含酶溶剂中吸附色素物质时，可同时去除非活性蛋 白质白质 2 2、发酵液的固、发酵液的固- -液分离液分离 离心和过滤离心和过滤 菌种对过滤速度影响很大菌种对过滤速度影响很大 真菌容易过滤，放线菌则难真菌容易过滤，放线菌则难 培养基组成对过滤也有影响培养基组成对过滤也有影响 8 （二）细胞破碎（二）细胞破碎 1 1、细胞壁与细胞破碎、细胞壁与细胞破碎 2 2、细胞破碎的方法、细胞破碎的方法 1 1）机械法：）机械法： 珠磨法珠磨法（bead mill）实验室：实验室：Mickle捣碎机；中

6、试：胶质膜处理；工捣碎机；中试：胶质膜处理；工 业：高速珠磨机业：高速珠磨机 高压匀浆法：高压匀浆法：大规模细胞破碎方法；对于酵母等难破碎及高浓度大规模细胞破碎方法；对于酵母等难破碎及高浓度 细胞可采用多次循环方法；丝状真菌、较小的细胞可采用多次循环方法；丝状真菌、较小的G G+ +菌，含有包含体菌，含有包含体 （Inclusion bodyInclusion body）的基因工程菌不宜用此法的基因工程菌不宜用此法。 超声波法超声波法（Ultrasonication）：杆菌比球菌容易破碎；杆菌比球菌容易破碎； G G- -比比 G G+ +容易容易 破碎；酵母菌不易破碎；实验室较常用的方法，样

7、品温度？破碎；酵母菌不易破碎；实验室较常用的方法，样品温度？ 9 2 2）非机械法：酶法、化学法、物理法）非机械法：酶法、化学法、物理法 化学渗透法化学渗透法（chemical permeation）：改变细胞壁或细胞膜的通改变细胞壁或细胞膜的通 透性；透性；TritonX-100TritonX-100：结合、溶解磷脂，破坏膜脂双层；结合、溶解磷脂，破坏膜脂双层；EDTAEDTA：对对G G- -菌菌 外膜有破坏作用；有机溶剂：分解细胞壁中的脂类；变性剂：脲、盐外膜有破坏作用；有机溶剂：分解细胞壁中的脂类；变性剂：脲、盐 酸胍与水中氢键作用。优点：选择性，易于固液分离。缺点：通用性酸胍与水中氢

8、键作用。优点：选择性，易于固液分离。缺点：通用性 差，效率低，毒性差，效率低，毒性 10 JJ-2组织捣碎匀浆机 11 ZMZM系列系列卧式密闭珠卧式密闭珠( (砂砂) )磨机磨机 12 （三）酶的提取（三）酶的提取（extraction） 1 1、盐溶液提取：、盐溶液提取： 盐溶（盐溶（salting in） 在低浓度盐溶液中，酶的溶解度增加。在低浓度盐溶液中，酶的溶解度增加。 常用稀盐溶液（常用稀盐溶液（0.02-0.50.02-0.5mol/Lmol/L）。）。 2 2、酸、碱溶液提取酸、碱溶液提取 3 3、有机溶剂提取、有机溶剂提取 13 （四）离心分离（四）离心分离 1 1、离心机种

9、类、离心机种类 (1)(1)常速离心机常速离心机 最大转速最大转速8000 8000 r/min,r/min,相对离心力相对离心力 （RCF)1RCF)110104 4g g (2)(2)高速离心机高速离心机 1 110104 4 r/min r/min转速转速2.62.610104 4 r/min, r/min, 8 810103 3gRCF1gRCF110105 5g g (3)(3)超速离心机超速离心机 转速转速2.52.510104 4 r/min, RCF1 r/min, RCF110105 5g g 14 TGL-16MTGL-16M高速台式冷冻离心机高速台式冷冻离心机 15 2

10、2、离心分离方法、离心分离方法 （1 1）差速离心）差速离心( (differential centrifugation) ) （2 2）密度梯度离心密度梯度离心( (density gradient centrifugation) ) （3 3）等密度梯度离心等密度梯度离心( (sendimentation equilibrium centrifugation) 3 3、离心条件离心条件 （1 1）离心力）离心力 相对离心力相对离心力RCF=1.12=1.121010-5 -5 rnrn2 2 g g （2 2）离心时间离心时间 （3 3）温度和）温度和pHpH 16 离离 心心 条条 件件

11、沉沉 淀淀 的的 亚亚 细细 胞胞 成成 分分 1,0001,000g g 5 5minmin 真核细胞真核细胞 4,0004,000g g 1010minmin 叶绿体叶绿体 真核细胞碎片真核细胞碎片 细胞核细胞核 15,00015,000g g 2020minmin 线粒体线粒体 细菌细菌 30,000 30,000g g 30 30minmin 溶酶体溶酶体 细菌菌体碎片细菌菌体碎片 100,000 100,000g g 180 180minmin 核糖体核糖体 多聚核糖体多聚核糖体 用差速离心法分离亚细胞成分用差速离心法分离亚细胞成分 17 18 19 （五）沉淀分离（五）沉淀分离 1

12、 1、盐析法、盐析法 盐溶盐溶(salting in) 在低浓度盐溶液中，酶的溶解度增加。在低浓度盐溶液中，酶的溶解度增加。 盐析盐析(salting out) 盐浓度升高到一定程度，蛋白质和酶浓盐浓度升高到一定程度，蛋白质和酶浓 度随盐浓度的升高而不同程度下降并沉淀析出。度随盐浓度的升高而不同程度下降并沉淀析出。 （1 1）盐析法的机制）盐析法的机制 （2 2）盐析用中性盐的选择）盐析用中性盐的选择 常用的中性盐：常用的中性盐：MgSO4、(NH4)2SO4、Na2SO4和和NaH2PO4 （3 3）(NH4)2SO4饱和度表示法饱和度表示法 （4）影响）影响盐析盐析的因素的因素 1）蛋白质

13、浓度）蛋白质浓度 2）pH和温度的影响和温度的影响 20 21 蛋白质的盐析蛋白质的盐析 22 盐析盐析应用最广泛的是硫酸铵应用最广泛的是硫酸铵 优点优点 1 1）溶解度大）溶解度大 25 25时硫酸铵的溶解度可达时硫酸铵的溶解度可达4.14.1mol/L(541g/L)mol/L(541g/L)以上。大以上。大 约每升水可溶解约每升水可溶解767767g g之多。在这一高溶解度范围内，许多蛋白质和酶之多。在这一高溶解度范围内，许多蛋白质和酶 都可以被盐析沉淀出来。都可以被盐析沉淀出来。 2 2）温度系数小）温度系数小 硫酸铵的溶解度受温度影响不大。例如硫酸铵的溶解度受温度影响不大。例如00时

14、，硫酸时，硫酸 铵的溶解度仍可达到铵的溶解度仍可达到3.93.9mol/L(515g/L)mol/L(515g/L)。大约每升水可溶解大约每升水可溶解676676g g。对对 于需要在低温条件下进行酶的纯化来说，应用硫酸铵是有利的。于需要在低温条件下进行酶的纯化来说，应用硫酸铵是有利的。 3 3）硫酸铵不易引起蛋白质变性，对于很多种酶还有保护作用，且价格）硫酸铵不易引起蛋白质变性，对于很多种酶还有保护作用，且价格 低廉，容易获得。低廉，容易获得。 缺点缺点 铵离子干扰双缩脲反应，为蛋白质的定性分析造成一定困难。铵离子干扰双缩脲反应，为蛋白质的定性分析造成一定困难。 23 (NH4)2SO4饱和

15、度表饱和度表 24 温度是影响蛋白质溶解度的重要因素。在无盐或稀盐溶液温度是影响蛋白质溶解度的重要因素。在无盐或稀盐溶液 中，温度低，蛋白质溶解度也低；在高盐溶液中，蛋白质中，温度低，蛋白质溶解度也低；在高盐溶液中，蛋白质 的溶解度随温度的升高反而减小。许多蛋白质在高离子强的溶解度随温度的升高反而减小。许多蛋白质在高离子强 度溶液中，度溶液中，2525时的溶解度比时的溶解度比00时明显减小。这主要是时明显减小。这主要是 因为蛋白质分子在水化时要吸热，失水时则放热，温度升因为蛋白质分子在水化时要吸热，失水时则放热，温度升 高有利于蛋白质失水沉淀。一般盐析时不要降低温度，除高有利于蛋白质失水沉淀。

16、一般盐析时不要降低温度，除 非这种酶对温度比较敏感。非这种酶对温度比较敏感。 盐析盐析pHpH的选择以不降低酶的活性为原则，通常通过试验选的选择以不降低酶的活性为原则，通常通过试验选 择酶稳定的择酶稳定的pHpH范围进行盐析。范围进行盐析。 25 盐析法的优点：操作简便、使用广泛、去杂纯化效果好。盐析法的优点：操作简便、使用广泛、去杂纯化效果好。 浓缩作用，有利于进一步纯化。浓缩作用，有利于进一步纯化。 缺点：分辨能力差，纯化倍数低。得到的蛋白质或酶含缺点：分辨能力差，纯化倍数低。得到的蛋白质或酶含 大量盐粉，需脱盐后进一步纯化。大量盐粉，需脱盐后进一步纯化。 26 2 2、有机溶剂法、有机溶

17、剂法 利用利用酶等蛋白质在水溶性有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙酶等蛋白质在水溶性有机溶剂（如甲醇、乙醇和丙 酮）中溶解度降低而使之分离的方法。酮）中溶解度降低而使之分离的方法。 （1 1）有机溶剂沉淀法的）有机溶剂沉淀法的机理机理 1 1）主要效应是降低水溶液的介电常数主要效应是降低水溶液的介电常数(dielectric constant)。 介电常数用于衡量绝缘体储存电能的性能。介电常数代表介电常数用于衡量绝缘体储存电能的性能。介电常数代表 了电介质的极化程度，也就是对电荷的束缚能力，介电常了电介质的极化程度，也就是对电荷的束缚能力，介电常 数越大，对电荷的束缚能力越强。带电离子基团之间的作数越

18、大，对电荷的束缚能力越强。带电离子基团之间的作 用力随介电常数的减小而增大。带电溶质便互相吸引凝集用力随介电常数的减小而增大。带电溶质便互相吸引凝集 而沉淀。（而沉淀。（ 20 20时介电常数：水时介电常数：水8080，甲醇，甲醇3333，乙醇，乙醇2424，丙，丙 酮酮21.421.4 ） 2 2）破坏蛋白质表面水膜，而使蛋白质聚集沉淀破坏蛋白质表面水膜，而使蛋白质聚集沉淀。 3 3）作为变性剂，破坏蛋白质氢键等化学键作为变性剂，破坏蛋白质氢键等化学键。 27 有机溶剂沉淀法有机溶剂沉淀法 优点：分辨率高；密度低，便于离心分离；沉淀不需脱优点：分辨率高；密度低，便于离心分离；沉淀不需脱 盐；

19、溶剂易于蒸发除去，适于食品工业用酶制剂的制备。盐；溶剂易于蒸发除去，适于食品工业用酶制剂的制备。 缺点：容易使酶变性失活；安全要求较高；操作必须在缺点：容易使酶变性失活；安全要求较高；操作必须在 低温下进行。低温下进行。 28 （2 2）有机溶剂的选择和用量）有机溶剂的选择和用量 与水互溶有机溶剂包括甲醇、乙醇和丙酮，其中甲醇和与水互溶有机溶剂包括甲醇、乙醇和丙酮，其中甲醇和 丙丙 酮有一定毒性。沉淀能力顺序是丙酮酮有一定毒性。沉淀能力顺序是丙酮 乙醇乙醇 甲醇。工业上多用甲醇。工业上多用 乙醇作为沉淀剂。乙醇作为沉淀剂。 （3 3）影响有机溶剂沉淀的因素）影响有机溶剂沉淀的因素 1 1）温度

20、）温度 2 2）pHpH 3 3）离子强度离子强度 4 4）蛋白质浓度）蛋白质浓度 3 3、等电点法、等电点法(isoelectric precipitation) 4 4、其他沉淀法其他沉淀法 29 （六）萃取分离（六）萃取分离(extraction) 概念概念: :P154P154 1 1、溶剂萃取法溶剂萃取法 比沉淀分离程度高比沉淀分离程度高, ,比离子交换法选择性好比离子交换法选择性好, , 传质速度快传质速度快, ,生产周期段生产周期段, ,便于连续操作便于连续操作, ,容易实现自动化容易实现自动化. . 2 2、双水相萃取法、双水相萃取法(Partion of two aqueou

21、s phase extraction) 用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液进行萃取用两种不相溶的亲水性高分子聚合物水溶液进行萃取. . 3 3、超临界流体萃取法、超临界流体萃取法 4 4、反胶团萃取法、反胶团萃取法 30 双水相萃取双水相萃取 法法 双水相：双水相：将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混和时，当聚合物浓将两种不同的水溶性聚合物的水溶液混和时，当聚合物浓 度达到一定值，体系会自然地分成互不相溶的两相。度达到一定值，体系会自然地分成互不相溶的两相。 如：如：当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉的水溶液混合时，就得到一当明胶与琼脂或明胶与可溶性淀粉的水溶液混合时，就得到一 个浑浊不透明的溶

22、液，它随之分成两个液相，这就是双水相体系。个浑浊不透明的溶液，它随之分成两个液相，这就是双水相体系。 用于生物分离的高聚物体系有：聚乙二醇用于生物分离的高聚物体系有：聚乙二醇( (简称简称PEG) )葡聚糖葡聚糖( (简称简称 Dextran) )和和PEGDextran硫酸盐体系。常见的高聚物无机盐体系为：硫酸盐体系。常见的高聚物无机盐体系为： PEG硫酸盐或磷酸盐体系。硫酸盐或磷酸盐体系。 原理：原理：生物物质在双水相体系中的选择性分配。生物物质在双水相体系中的选择性分配。( (酶、蛋白质等生物酶、蛋白质等生物 大分子的分配系数大致在大分子的分配系数大致在0.1-100.1-10之间之间)

23、 )。 31 各种双水相系统各种双水相系统 32 双水相系统的应用双水相系统的应用 33 二、酶的精制二、酶的精制 根据原理根据原理, ,酶的纯化方法分为酶的纯化方法分为: : 1) 1)沉淀法沉淀法;2);2)相分配法相分配法;3);3)柱层析法柱层析法;4);4)电泳或离心法。电泳或离心法。 酶纯化的基本原则酶纯化的基本原则: : 1) 1)建立方便灵敏的分析方法建立方便灵敏的分析方法; ; 2) 2)选择有效的纯化方法选择有效的纯化方法; ; 3) 3)尽量避免变性尽量避免变性; ; 4) 4)尽量避免过度暴露于空气中尽量避免过度暴露于空气中. . 34 酶的理化性质与分离纯化方法酶的理

24、化性质与分离纯化方法 理化性质理化性质分离及纯化方法分离及纯化方法 分子大小和形态分子大小和形态 溶解度溶解度 电荷差异电荷差异 生物功能专一性生物功能专一性 差速离心、超滤、分子筛、透析差速离心、超滤、分子筛、透析 盐析、萃取、分配层析、结晶盐析、萃取、分配层析、结晶 电泳、等电聚焦电泳、离子交换层析电泳、等电聚焦电泳、离子交换层析 亲和层析亲和层析 35 （一）膜分离（一）膜分离 原理原理 利用溶液中溶质分子的大小、形状、性质等的利用溶液中溶质分子的大小、形状、性质等的 差别差别, ,对于各种薄膜表现出不同的可透性而达到分离的目对于各种薄膜表现出不同的可透性而达到分离的目 的。的。 膜分离

25、技术分为反渗透膜分离技术分为反渗透(RO)、超滤、超滤( (UF)、纳滤、纳滤(NF)、 微滤微滤(MF)。主要区别在于膜孔径的大小。酶纯化中常用的。主要区别在于膜孔径的大小。酶纯化中常用的 是超滤和微滤是超滤和微滤, ,特别是浓缩和脱盐。特别是浓缩和脱盐。 36 几种膜分离技术特点几种膜分离技术特点 37 1 1、透析、透析( (dialysis) ) 原理原理 P159P159 1) 1)透析膜透析膜 纤维素或其衍生物制成。透析袋已经商品化。纤维素或其衍生物制成。透析袋已经商品化。 2) 2)透析袋预处理透析袋预处理 3) 3)透析方法及装置透析方法及装置 2. 2.超滤超滤 原理原理 P

26、164-165P164-165 利用具有一定孔径的微孔滤膜，对生物大分子溶液进行过滤利用具有一定孔径的微孔滤膜，对生物大分子溶液进行过滤 （常压、加压或减压），使大分子保留在超滤膜上面的溶液中，小分（常压、加压或减压），使大分子保留在超滤膜上面的溶液中，小分 子物质及水过滤出去，从而达到脱盐、更换缓冲液或浓缩的目的。这子物质及水过滤出去，从而达到脱盐、更换缓冲液或浓缩的目的。这 种利用超滤膜过滤分离大分子和小分子物质的方法叫做超滤法。超滤种利用超滤膜过滤分离大分子和小分子物质的方法叫做超滤法。超滤 膜的截留分子量范围从膜的截留分子量范围从50005000到到500000500000。 38 透

27、析方法示意图透析方法示意图 超滤工作示意图超滤工作示意图 39 40 41 （二）凝胶过滤法（二）凝胶过滤法(gel filtration) 1 1、原理、原理 42 43 2 2、凝胶的种类凝胶的种类 1.1. 44 交联葡聚糖凝胶结构的示意图交联葡聚糖凝胶结构的示意图 45 葡聚糖凝胶的种类和规格葡聚糖凝胶的种类和规格 46 47 48 3 3、凝胶过滤技术凝胶过滤技术 4 4、凝胶过滤技术的应用、凝胶过滤技术的应用 49 （三）离子交换层析（三）离子交换层析(Ion Exchange Chromatography,IEC) 1 1、原理、原理 50 51 离子交换吸附洗脱示意图离子交换吸

28、附洗脱示意图 52 2 2、离子交换剂、离子交换剂 53 3 3、离子交换技术：、离子交换技术：P182P182 54 （四）疏水层析（四）疏水层析(Hydrophobic Chromatography) 1 1、原理、原理 一些疏水性较强的介质对疏水性较大的蛋白质有较强的一些疏水性较强的介质对疏水性较大的蛋白质有较强的 吸附作用，而且吸附后不容易被洗脱下来。尽管多数蛋白质吸附作用，而且吸附后不容易被洗脱下来。尽管多数蛋白质 都溶于水，具有较强的亲水性，但实际上分子内部都存在着都溶于水，具有较强的亲水性，但实际上分子内部都存在着 一个疏水核心中心，分子构象十分复杂。分子内部都不同程一个疏水核心

29、中心，分子构象十分复杂。分子内部都不同程 度存在着一些疏水基团或疏水中心区。如蛋白质表面含有某度存在着一些疏水基团或疏水中心区。如蛋白质表面含有某 些非极性氨基酸侧链，其中包括些非极性氨基酸侧链，其中包括LeuLeu、PhePhe、TrpTrp、AlaAla、ProPro等等 氨基酸，这些非极性氨基酸侧链组成了蛋白质疏水核心中氨基酸，这些非极性氨基酸侧链组成了蛋白质疏水核心中 心，决定了蛋白质的疏水性质。心，决定了蛋白质的疏水性质。P188P188 55 2 2、疏水层析介质：、疏水层析介质：P188 3 3、疏水层析技术：、疏水层析技术：P189 56 （五）吸附层析（五）吸附层析(Abso

30、rption Chromatography) 1 1、原理、原理 液一固吸附层析是运用较多的一种方法，特别适用液一固吸附层析是运用较多的一种方法，特别适用 于很多中等分子量的样品（分子量小于于很多中等分子量的样品（分子量小于1 1，000000的低挥发的低挥发 性样品）的分离，尤其是脂溶性成分。一般不适用于高性样品）的分离，尤其是脂溶性成分。一般不适用于高 分子量样品如蛋白质、多糖或离子型亲水住化合物等的分子量样品如蛋白质、多糖或离子型亲水住化合物等的 分离。吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、溶剂和被分离。吸附层析的分离效果，决定于吸附剂、溶剂和被 分离化合物的性质这三个因素。分离化合物的性质

31、这三个因素。 57 2 2、吸附介质、吸附介质 常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、硅酸镁、聚酰 胺、硅藻土等。胺、硅藻土等。 （1 1）硅胶：层析用硅胶为一多孔性物质，分子中具有硅氧）硅胶：层析用硅胶为一多孔性物质，分子中具有硅氧 烷的交链结构，同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附烷的交链结构，同时在颗粒表面又有很多硅醇基。硅胶吸附 作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基能够通过氢键作用的强弱与硅醇基的含量多少有关。硅醇基能够通过氢键 的形成而吸附水分，因此硅胶的吸附力随吸着的水分增加而的形成而吸附水分，因此硅胶的吸附力随吸着的水分增加而

32、降低。若吸水量超过降低。若吸水量超过1717，吸附力极弱不能用作为吸附剂。，吸附力极弱不能用作为吸附剂。 58 （2 2）活性炭：）活性炭： 使用较多的一种非极性吸附剂。一般需要先用稀盐酸洗涤，其次用乙使用较多的一种非极性吸附剂。一般需要先用稀盐酸洗涤，其次用乙 醇洗，再以水洗净，于醇洗，再以水洗净，于8080干燥后即可供层析用。层析用的活性炭，最干燥后即可供层析用。层析用的活性炭，最 好选用颗粒活性炭，若为活性炭细粉，则需加入适量硅藻土作为助滤剂好选用颗粒活性炭，若为活性炭细粉，则需加入适量硅藻土作为助滤剂 一并装柱，以免流速太慢。活性炭主要且于分离水溶性成分，如氨基酸、一并装柱，以免流速太

33、慢。活性炭主要且于分离水溶性成分，如氨基酸、 糖类及某些甙。活性炭的吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则糖类及某些甙。活性炭的吸附作用，在水溶液中最强，在有机溶剂中则 较低弱。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。例如以醇较低弱。故水的洗脱能力最弱，而有机溶剂则较强。例如以醇- -水进行洗水进行洗 脱时，则随乙醇浓度的递增而洗脱力增加。活性炭对芳香族化合物的吸脱时，则随乙醇浓度的递增而洗脱力增加。活性炭对芳香族化合物的吸 附力大于脂肪族化合物，对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。附力大于脂肪族化合物，对大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。 利用这些吸附性的差别，可将水溶性芳香族物质与

34、脂肪族物质分开，单利用这些吸附性的差别，可将水溶性芳香族物质与脂肪族物质分开，单 糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开。糖与多糖分开，氨基酸与多肽分开。 3 3、吸附层析技术：、吸附层析技术：P192 59 1 1、原理、原理 将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析将具有特殊结构的亲和分子制成固相吸附剂放置在层析 柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂柱中，当要被分离的蛋白混合液通过层析柱时，与吸附剂 具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那具有亲和能力的蛋白质就会被吸附而滞留在层析柱中。那 些没有亲和力的蛋白质由于不被吸附，直接流出，从而与些没有亲和力的蛋白质由于不

35、被吸附，直接流出，从而与 被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合被分离的蛋白质分开，然后选用适当的洗脱液，改变结合 条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的条件将被结合的蛋白质洗脱下来，这种分离纯化蛋白质的 方法称为亲和层析。方法称为亲和层析。 具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体、具有专一亲和力的生物分子对主要有：抗原与抗体、 DNADNA与互补与互补DNADNA或或RNARNA、酶与它的底物或竞争性抑制剂、激素酶与它的底物或竞争性抑制剂、激素 （或药物）与它们的受体、维生素和它的特异结合蛋白、（或药物）与它们的受体、维生素和它的特异结合蛋白、 糖蛋白与它相应的

36、植物凝集素等。糖蛋白与它相应的植物凝集素等。 （六）亲和层析（六）亲和层析(Affinity Chromatography) 60 亲和层析基本过程亲和层析基本过程 61 2 2、亲和介质：、亲和介质：P194 P194 载体与配基概念载体与配基概念 亲和层析中最常用的载体为琼脂糖凝胶，如亲和层析中最常用的载体为琼脂糖凝胶，如Sephrose 2B， 4B和和6B等，在结合配基前须先经溴化氰等，在结合配基前须先经溴化氰( (BrCN)BrCN)活化，然后活化，然后 才能和配基的游离氨基才能和配基的游离氨基( (脂肪族或芳香族氨基脂肪族或芳香族氨基) )相偶连。相偶连。 3 3、亲和层析技术：亲

37、和层析技术：P197-198 62 三、电泳（三、电泳（electrophoresis） 目前电泳技术已被广泛应用于蛋白质、核酸和氨基酸等目前电泳技术已被广泛应用于蛋白质、核酸和氨基酸等 物质的分离和鉴定。物质的分离和鉴定。 电泳电泳: :溶液中，带电粒子在外加电场的作用下，向相反溶液中，带电粒子在外加电场的作用下，向相反 电极方向移动的现象。电极方向移动的现象。 影响电泳效果的因素：电荷、大小、介质粘度、影响电泳效果的因素：电荷、大小、介质粘度、pHpH值值、 缓冲液的离子强度、电渗、电场强度缓冲液的离子强度、电渗、电场强度 63 1 1、电泳基本原理、电泳基本原理 蛋白质的两性电离和等电点

38、蛋白质的两性电离和等电点 蛋白质是由许多氨基酸通过肽键连成的高分子化合物。每种蛋白质是由许多氨基酸通过肽键连成的高分子化合物。每种 蛋白质都有特定的一级结构和空间结构。蛋白质空间结构的蛋白质都有特定的一级结构和空间结构。蛋白质空间结构的 共同特点是疏水基团（烃基，苯基等）通常隐藏在分子中央，共同特点是疏水基团（烃基，苯基等）通常隐藏在分子中央， 而亲水基团（羧基，氨基，羟基）则暴露在分子的表面。因而亲水基团（羧基，氨基，羟基）则暴露在分子的表面。因 此，蛋白质是一种亲水胶体。此，蛋白质是一种亲水胶体。 64 蛋白质在水溶液中可因这些亲水基团的电离而带有电荷。蛋白质在水溶液中可因这些亲水基团的电

39、离而带有电荷。 在酸性溶液中，羧基的电离受抑制，而氨基可与质子（在酸性溶液中，羧基的电离受抑制，而氨基可与质子（H H）结结 合成正离子。在碱性溶液中，羧基上的（合成正离子。在碱性溶液中，羧基上的（H H）可与氢氧根结合可与氢氧根结合 成水，使蛋白质带负电荷。蛋白质的这一性质叫两性电离。成水，使蛋白质带负电荷。蛋白质的这一性质叫两性电离。 如果在某一如果在某一pHpH时，蛋白质电离成正离子或负离子的程度相时，蛋白质电离成正离子或负离子的程度相 等，即蛋白质分子的净电荷为零。则称此等，即蛋白质分子的净电荷为零。则称此pHpH值为蛋白质的值为蛋白质的等等 电点（电点（PIPI）。 蛋白质的等电点与

40、其分子结构有关。不同的蛋白质由于其蛋白质的等电点与其分子结构有关。不同的蛋白质由于其 分子结构不同而有不同的等电点。如果要分离一组等电点不同分子结构不同而有不同的等电点。如果要分离一组等电点不同 的蛋白质，只要选择一个合适的的蛋白质，只要选择一个合适的pHpH，使各种蛋白质在该使各种蛋白质在该PHPH时的时的 净电荷差异最大，就可以用电泳方法达到满意的分离效果。净电荷差异最大，就可以用电泳方法达到满意的分离效果。 65 2 2、电泳的分类、电泳的分类 根据被分离样品的多少，可分为分析电泳及制备电泳。根据被分离样品的多少，可分为分析电泳及制备电泳。 根据电泳电压的高低，分为高压电泳及常压电泳：常

41、压电根据电泳电压的高低，分为高压电泳及常压电泳：常压电 压一般在压一般在600600v v 以下，电位梯度为以下，电位梯度为2-102-10v /cmv /cm。 根据是否使用支持介质，分为自由电泳，区带电泳。根据是否使用支持介质，分为自由电泳，区带电泳。 自由电泳：不用支持介质，电泳在溶液中进行。自由电泳：不用支持介质，电泳在溶液中进行。 区带电泳：使用支持介质，应用广泛。根据支持介质的区带电泳：使用支持介质，应用广泛。根据支持介质的 不同，又可分为滤纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，琼脂糖不同，又可分为滤纸电泳，醋酸纤维素薄膜电泳，琼脂糖 凝胶电泳以及聚丙烯酰胺凝胶电泳等。凝胶电泳以及聚丙烯酰胺

42、凝胶电泳等。 66 根据电泳系统的组成是否均一，分为连续电泳，不连续电泳。根据电泳系统的组成是否均一，分为连续电泳，不连续电泳。 连续电泳：整个电泳系统使用相同的支持介质和缓冲液。连续电泳：整个电泳系统使用相同的支持介质和缓冲液。 不连续电泳：电泳系统使用不同的支持介质（包括凝胶不连续电泳：电泳系统使用不同的支持介质（包括凝胶 的浓度与孔径等）和不同的缓冲液（包括缓冲液的组成与的浓度与孔径等）和不同的缓冲液（包括缓冲液的组成与pHpH 等）。等）。 67 3 3、常用电泳技术、常用电泳技术 醋酸纤维素薄膜电泳醋酸纤维素薄膜电泳 醋酸纤维素是将纤维素的羟基乙酰化形成的纤维素醋醋酸纤维素是将纤维素

43、的羟基乙酰化形成的纤维素醋 酸酯，由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。酸酯，由该物质制成的薄膜称为醋酸纤维素薄膜。 该薄膜对蛋白质样品吸附性小，又因膜的亲水性小，该薄膜对蛋白质样品吸附性小，又因膜的亲水性小， 它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导，它所容纳的缓冲液也少，电泳时电流的大部分由样品传导， 所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少，特别适合于所以分离速度快，电泳时间短，样品用量少，特别适合于 病理情况下微量异常蛋白的检测。病理情况下微量异常蛋白的检测。 醋酸纤维素薄膜经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处醋酸纤维素薄膜经过冰醋酸乙醇溶液或其它透明液处 理后，可使膜透明化有利于

44、对电泳图谱的光吸收扫描、测理后，可使膜透明化有利于对电泳图谱的光吸收扫描、测 定和膜的长期保存。定和膜的长期保存。 过程：膜预处理过程：膜预处理 加样加样 电泳电泳 染色染色 脱色与透明脱色与透明 检测检测 68 琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳 用琼脂糖凝胶作为支持物的电泳。琼脂糖是从琼脂中用琼脂糖凝胶作为支持物的电泳。琼脂糖是从琼脂中 分离得到的一种多糖，占琼脂含量的分离得到的一种多糖，占琼脂含量的80%80%，是一种优良的，是一种优良的 电泳材料，广泛用于同工酶，血浆脂蛋白分离，也可用于电泳材料，广泛用于同工酶，血浆脂蛋白分离，也可用于 免疫电泳。免疫电泳。 聚丙烯酰聚丙烯酰胺胺凝胶电泳凝胶

45、电泳 1 1）聚丙烯酰胺凝胶的聚合：聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰氨（）聚丙烯酰胺凝胶的聚合：聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰氨（AcrAcr） 和甲叉双丙烯酰胺（和甲叉双丙烯酰胺（BISBIS）通过化学催化或光催化聚合成三维立体空通过化学催化或光催化聚合成三维立体空 间的多聚物。化学聚合的催化剂常用过硫酸铵。为加速反应，需加间的多聚物。化学聚合的催化剂常用过硫酸铵。为加速反应，需加 TEMED-TEMED-四甲基乙二胺作为加速剂。催化反应需碱性环境，如四甲基乙二胺作为加速剂。催化反应需碱性环境，如pHpH为为8.38.3， 丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的浓度为7%7%，3030minmin就可聚合完毕。就可聚合完毕。 69 2 2）聚丙烯酰胺凝胶）聚丙烯酰胺凝胶的孔径与机械强度的孔径与机械强度 聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶的的分离效果与凝胶孔径有关，凝胶孔径由凝胶分离效果与凝胶孔径有关，凝胶孔径由凝胶 总浓度和交联度决定。凝胶总浓度总浓度和交联度决定。凝胶总浓度T T（g/dlg/dl）表示表示100100mlml凝胶中丙烯凝胶中丙烯 酰胺和甲叉双丙烯酰胺的总克数。酰胺和甲叉双丙烯酰胺的总克数。T T值越大，孔径越小。交联度值越大，孔径越小。交联度C C表表 示交联剂示交联剂BISBIS占凝胶总浓度占凝胶总浓度T T的百分比。的百分比。C C值越大，孔径越小。值越大，孔径越