酸性磷酸酶的课件

1、1 酸性磷酸酶的酸性磷酸酶的 分离纯化和动力学分析分离纯化和动力学分析 李李 平平 法法 2 概概 述述 n酶在物质代谢及调节中的重要意义；酶在物质代谢及调节中的重要意义； n常用的酶蛋白分离纯化方法；常用的酶蛋白分离纯化方法； n酶类检测在临床生化检验中的意义；酶类检测在临床生化检验中的意义； n酸性磷酸酶作用特性及动力学特点。酸性磷酸酶作用特性及动力学特点。 3 目目 的的 要要 求求 1. 1. 巩固诊断酶学有关的理论与实验知识；巩固诊断酶学有关的理论与实验知识； 2. 2. 掌握酶的分离纯化方法；掌握酶的分离纯化方法； 3. 3. 掌握酸性磷酸酶（掌握酸性磷酸酶（aicd phosph

2、atase ACP） 活性测定的原理、方法和影响因素；活性测定的原理、方法和影响因素； 4. 熟悉酶活性测定的条件选择和方法建立。熟悉酶活性测定的条件选择和方法建立。 4 试剂与器材试剂与器材 一、一、ACP的分离纯化试剂：见实验的分离纯化试剂：见实验 教材教材P31； 二、二、ACP动力学分析试剂：见实验动力学分析试剂：见实验 教材教材P35； 三、三、器材：普通离心机，器材：普通离心机，721分光光分光光 度计，恒温水浴箱，研钵等。度计，恒温水浴箱，研钵等。 5 实实 验验 内内 容容 一、一、 ACP的分离纯化的分离纯化 二、二、 ACP的比活性分析的比活性分析 三、三、 ACP的动力学

3、分析的动力学分析 1. 时间进程（时间进程（t-V ）曲线）曲线 2. 酶浓度酶浓度-速度（速度（E-V） 曲线曲线 3. pH-酶活性酶活性 （pH-V）曲线）曲线 4.底物浓度底物浓度-速度（速度（S-V） 曲线曲线 5.抑制剂抑制剂-速度（速度（I-V）曲线）曲线 6 一、一、 ACP的分离纯化的分离纯化 1.概况：概况： ACP分布广泛分布广泛 分子量分子量100kD 最适最适pH5.0 热稳定性较好热稳定性较好 溶解度较高溶解度较高 临床应用广临床应用广 7 2. ACP的分离纯化方法的分离纯化方法 根据根据ACP的理化性质，可以用层析、电的理化性质，可以用层析、电 泳、透析等多种方

4、法分离纯化。泳、透析等多种方法分离纯化。 本实验采用分级离心本实验采用分级离心+分段盐析法：分段盐析法： ACP与其它成分（细胞膜、杂蛋白）与其它成分（细胞膜、杂蛋白） 密度不同，以次逐步离心分离；密度不同，以次逐步离心分离； ACP能溶解于水和低饱和度的硫酸铵能溶解于水和低饱和度的硫酸铵 溶液，在溶液，在70C仍保持稳定，以此进行杂蛋白仍保持稳定，以此进行杂蛋白 的变性沉淀和分段盐析。的变性沉淀和分段盐析。 8 3.ACP分离纯化的步骤流程分离纯化的步骤流程 小麦胚芽小麦胚芽100g+200ml冷蒸馏水冷蒸馏水 滤滤 液液 研碎，研碎，4层纱布过滤层纱布过滤 3500rpm，10min离心离

5、心 上清液上清液 I 4000rpm，10min离心离心 1mol/L MnCl2 2ml/100ml上清液上清液 I 上清液上清液 II （激活并稳定（激活并稳定ACP， 沉淀杂蛋白）沉淀杂蛋白） 缓慢搅拌缓慢搅拌 9 4000rpm，8min离心离心 上清液上清液 5000rpm，10min离心离心 饱和硫酸铵饱和硫酸铵 54ml /100ml上清液上清液 II 上清液上清液 II （溶解（溶解ACP， 沉沉 淀杂蛋白）淀杂蛋白） 4000rpm，8min离心离心 上清液上清液 III 70C水浴水浴2min 冷水浴冷水浴3min 饱和硫酸铵饱和硫酸铵 51ml /100ml上清液上清液

6、II 沉淀沉淀（酶粗提物）（酶粗提物） （ 沉淀沉淀ACP） 缓慢搅拌缓慢搅拌 缓慢搅拌缓慢搅拌 10 4000rpm，10min离心离心 约约1/3上清液上清液 III蒸馏水，蒸馏水， 溶解，洗涤溶解，洗涤 （溶解（溶解ACP， 沉淀杂蛋白）沉淀杂蛋白） 4000rpm，10min离心离心 上清液上清液 IV 沉淀沉淀（酶粗提物）（酶粗提物） （ 沉淀沉淀ACP） EDTA9ml，饱和硫酸铵，饱和硫酸铵 10ml /100ml上清液上清液 IV， 2倍体积预冷甲醇倍体积预冷甲醇 沉沉 淀淀（酶纯化物）（酶纯化物） 4000rpm，10min离心离心蒸馏水溶解，洗涤蒸馏水溶解，洗涤 上清液上清

7、液 V （酶液）（酶液） 缓慢搅拌缓慢搅拌 11 1.各各上清液中蛋白质含量测定上清液中蛋白质含量测定 原理：染料结合比色法原理：染料结合比色法CBBG-250， max=595nm； 步骤：标准曲线制作步骤：标准曲线制作 各上清液中总蛋白测定（做平行管，各上清液中总蛋白测定（做平行管， 进进 行重复实验，减少随机误差。行重复实验，减少随机误差。 二、二、 ACP的比活性分析的比活性分析 12 2.各各上清液中上清液中ACP活性测定活性测定 酚酚-4-AAP显色法显色法:以磷酸苯二钠为底物，由以磷酸苯二钠为底物，由 ACP催化生成苯酚，在碱性条件下苯酚与催化生成苯酚，在碱性条件下苯酚与4- A

8、AP缩合最终生成红色醌类化合物，缩合最终生成红色醌类化合物， max = 510 nm； 注意：显色过程中两种缓冲液：注意：显色过程中两种缓冲液： 柠檬酸缓冲液柠檬酸缓冲液：pH5.0，提供，提供ACP反应条件反应条件 碳酸盐缓冲液碳酸盐缓冲液：pH10.0，提供成色反应条，提供成色反应条 件件 13 3.各各上清液中上清液中ACP比活性分析比活性分析 ACP活性单位定义：每分钟每毫升酶液产生活性单位定义：每分钟每毫升酶液产生 1nmol酚即酚即nmol/minml为为1个活性单位个活性单位； 纯化倍数纯化倍数= 各各上清液中上清液中ACP的比活性的比活性 上清液上清液I 中中ACP的比活性的

9、比活性 比活性比活性= 酶活性酶活性 U/ml 蛋白质含量蛋白质含量mg/ml 酶的回收率酶的回收率= 各各上清液中上清液中ACP的活性的活性 总体积总体积 上清液上清液I中中ACP的活性的活性 总体积总体积 还可以计算蛋白回收率，反映纯化效果，代表方法的特异性。还可以计算蛋白回收率，反映纯化效果，代表方法的特异性。 14 三、三、 ACP的动力学分析的动力学分析 1. 时间进程（时间进程（t-A ）曲线）曲线 A ACP的的 t-A 曲线曲线 时间（t） 酚生 成量 15 2. 酶浓度酶浓度-速度（速度（E-A）曲线）曲线 酶蛋白含量（E） 反应 速度 V ACP 的的 E-V 曲线曲线 1

10、6 3. pH-酶活性酶活性 （pH-V）曲线）曲线 pH 反应 速度 V 最适pH ACP的的pH-酶活性曲线酶活性曲线 17 1.影响方式：影响方式： 当当S较低时，较低时，V随随S的的 增加呈正比例增加增加呈正比例增加 当当S较高时，较高时，V随随S的的 增加减慢增加减慢 当当S增大到某一值时，增大到某一值时，V 达到最大反应速度达到最大反应速度Vmax 2.影响曲线：影响曲线： V S Vmax （矩形双曲线）（矩形双曲线） Km 4.底物浓度底物浓度-速度（速度（S-V）曲线）曲线 18 曲线方程曲线方程米米-曼氏方程曼氏方程 （1）米）米-曼氏方程曼氏方程： V= VmaxS Km

11、 + S V： 某一时刻的反应速度 S：某一时刻的底物浓度 Vmax： 反应系统能够达到的最大反应速度 Km：米氏常数 19 Km和和Vmax的测定：的测定： 双倒数作图法：将米氏方程两边取倒数双倒数作图法：将米氏方程两边取倒数 得得 1 1 1 V Vmax S Vmax =+ 1 V 1 S 纵截距= Km Km Vmax 斜率= Vmax 1 横截距= 1 Km - 20 1.抑制剂的概念：抑制剂的概念： 抑制剂（抑制剂（inhibitor）：）：能使酶的催化活性下降而能使酶的催化活性下降而 不引起酶蛋白变性的物质不引起酶蛋白变性的物质 2.抑制作用的分类：抑制作用的分类： 抑制作用抑制作用 不可逆性抑制不可逆性抑制 可逆性抑制可逆性抑制 竞争性抑制竞争性抑制 非竞争性抑制非竞争性抑制 反竞争性抑制反竞争性抑制 5.抑制剂抑制剂-速度（速度（I-A）曲线）曲线 21 竞争性抑制的动力学变化竞争性抑制的动力学变化 米米-曼氏方程变化为曼氏方程变化为： V= VmaxS Km（1+I/Ki） + S 此时， Km增大，增大， Vmax不变不变 1/V 1/S E + I E