SOCS3基因沉默调控树突状细胞分化成熟在白念珠菌感染中的作用及免疫学机制初探

1、socs基因沉默调控树突状细胞分化成熟在白念珠菌感染中的作用及免疫学机制初探第一部分:SiRNA介导的树突状细胞SOCS因沉默及沉默效率验证目的：构 建小鼠骨髓来源树突状细胞体外扩增培养方法，并制备siRNA介导的SOCS3K因 沉默树突状细胞。方法:(1)采用Lutz法在rmGM-CS和rmlL-4共同刺激下从小 鼠骨髓前体细胞诱导培养小鼠 BMDC并从形态学、细胞表面分子两方面对诱导培养的BMDCS行鉴定。设计并合成了 3条靶向SOCS因的siRNA干扰序列,定向克隆到慢病毒表达载体GV248经脂质体转染法转染BMDC收集转染后48h的各组DC细胞, 通过Western blot及qRT-

2、PC盼别在蛋白及基因水平验证其沉默效率,筛选沉默效率最佳的siRNA干扰序列。(3)通过Ann exin V-FITC荧光标记法和台盼蓝染色法检测siRNA转染对DC细胞活性的影响。结果:(1)体外诱导培养第8天即获得大量BMDC到置显微镜下观察细胞形态, 大部分细胞悬浮离散，可见树枝状突起，具有DC的典型形态学特征。采用流式细 胞术对诱导培养第8天DC表面分子情况进行检测，发现其高表达CDIIc(>90%),纯度满足下一步实验要求,低表达MHCII、CD40 CD86处于未成熟状态。(2) 转染后 48h,siRNA#1 Transfected DC、siRNA#2Transfecte

3、d DC、siRNA#3Transfected DC 组SOCS在mRNA口蛋白表达水平均较空白对照组显著下降 ,其 中siRNA#2在mRNA口蛋白水平的沉默效率均最佳(83.4%、82.7%),被用于后续试验。(3)controlDC组、non-target siRNA treated DC 组、siSOCS3treated DC组细胞凋亡率均&t;4%,台盼蓝染色显示三组DC细胞活性差异无统计学意义。结论: 通过体外诱导培养小鼠骨髓前体细胞的方法成功获得了足量高纯度的未成熟DC,siRNA SOCS在基因和蛋白水平有效沉默了 DC中SOCS基因。第二部分:SOCS3基因沉默对树突状细胞抗

4、白念珠菌感染的生物学特性和功能的影响 目的:探讨SOCS基因沉默对树突状细胞在白念珠菌感染中的生物学特性和功能 的影响。方法:(1)激光共聚焦扫描显微镜观察 DC对白念珠菌的吞噬现象，流式细胞仪检测SOCS基因沉默前后各组DC在不同时间点对白念珠菌的吞噬率；(2)通过 计数DC与白念珠菌共培养上清液的菌落形成单位比较 SOCS3基因沉默前后DC对白念珠菌的杀伤作用；(3)流式细胞仪检测白念珠菌刺激前后各组DC表面分子MHCI、CD40 CD86表达情况;(4)通过Tran swell迁移实验和检测DC表面趋化因子受体CCR7表达水平比较白念珠菌刺激前后各组 DC迁移能力。结果:(1)吞噬功能:

5、siSOCS3 DC组发生吞噬白念珠菌现象的 DC细胞数目明显多于control DC组，且siSCOS3 DC组单个细胞内吞噬的白念珠菌抱子数量明显多于control DC组,说明SOCS基因沉默促进了 DC对白念珠菌的吞噬作用；随着培养时间的延长,DC对白念珠菌的吞噬作用逐渐增强，至共培养60min时,DC对白念珠菌的吞噬 能力达顶峰 ,75min 开始下降。杀伤功能:siSOCS3DC组对白念珠菌的杀伤率高于 control DC 组和non-target siRNA DCS,说明SOCS基因沉默增强了 DC对白念珠菌的杀伤作用。细胞表面分子：经白念珠菌刺激成熟后，siSOCS3 DC组

6、细胞表面分子MHCII、CD40 CD86表达水平高于control DC组,说明SOCS基因沉默有效促进了白念珠菌诱导的DC表型成熟。迁移功能：经白念珠菌刺激成熟后，siSOCS3 DC组细胞迁移率以及CCR7表达水平均高于control DC 组、non-target siRNA DC 组,说明SOCS基因沉默有效增强了白念珠菌诱导成熟的 DC的细胞迁移功能。结论:SOCS3基因沉默促进了 DC对白念珠菌的吞噬、杀伤功能，DC经白念珠菌刺激后具备了更成熟的细胞表型,并获得了更强的细胞迁移功能,提示SOCS基因沉默增强了 DC在白念珠菌感染过程中的免疫原性。第三部分:SOCS3基因沉默DC通

7、过IL-6/STAT3通路增强Th17抗白念珠菌保 护性免疫应答目的：探讨SOCS基因沉默DC对初始T淋巴细胞增殖分化方向的影 响。方法: 通过ELISA、qRT-PCRWestern Blot检测各组DC中细胞因子IL-6、IL-12 的表达水平。通过Western blot检测各组DC中STAT3磷酸化水平。(3)免疫磁珠法分离小鼠脾脏T淋巴细胞,通过混合T淋巴细胞实验检测各组 DC刺激T淋巴细胞增殖的能力。(4)将各组DC与小鼠脾脏T淋巴细胞共培养,通过胞内因子染色法检测IFN-Y +CD4+1淋巴细胞(Thl)、IL-4+CD4+T淋巴细胞(Th2)、IL-17+CD4+T淋巴细胞 (

8、Th17)占CD4+T淋巴细胞的百分比,通过qRT-PCF检测Thl、Th2、Th17细胞转录因子T-bet、GATA3 ROY t mRNA表达水平。(5)加入外源性抗IL-6中和抗体,通过 WeesernBlot检测共培养体系中 ROY t、IL- 17A、1 L-23R的蛋白表达水平。结果:(1)经白念珠菌刺激成熟后,siSOCS3 DC组IL-6在蛋白及基因表达水平均明显高于control DC 组、non-target siRNA DC 组，但IL-12p35的基因表 达水平和 IL-12p70 的蛋白表达水平在三组间的差异均无统计学意义。 (2)经白念珠刺激成熟后,各组DC中 ST

9、AT3勺磷酸化水平均较相应未予白念珠菌刺激的对照组升高 , 其中 siSOCS3 DC 组 STAT3 的磷酸化水平较 control DC 组、non-target siRNA DC 组升高更明显。在与白念珠菌共培养后,各组DC诱导CD4+T淋巴细胞增殖的能力均较相应未予白念珠菌刺激的对照组增强 ; 当 DC:T 淋巴细胞比例为 1:200 及 1:50时,siS0CS3 DC组诱导CD4+T淋巴细胞增殖的能力较 control DC组及non-target siRNA DC组更明显。 经白念珠菌刺激成熟后,各组DC与 T淋巴细胞共培养体系中,IFN- Y +CD4+1淋巴细胞（Th1）、I

10、L-4+CD4+T淋巴细胞（Th2）、IL-17+CD4+T淋巴细胞（Th17）占CD4+T淋巴细胞的百分比均较相应未予白念珠菌刺激组升 高,siSOCS3 DC组IL-17+CD4+T淋巴细胞占CD4+1淋巴细胞的百分比高于 controlDC 组、 non-target siRNA DC 组, 但 IFN- Y +CD4+T 淋巴细胞及 IL-4+CD4+T淋巴细胞占CD4+T淋巴细胞的百分比在三组间无统计学差异。 经白念珠菌刺激成熟后,各组DC与 T淋巴细胞共培养体系中，T-bet、GATA3 ROY tmRNA水平均较相应未予白念珠菌刺激的对照组升高 ，siSOCS3 DC组 ROY t mRN水平高于 control DC 组和 non-target siRNA DC 组，但 T-bet、GATA3mRN水平在三组间无统计学差异。外源性IL-6中和抗体处理的 siSOCS3D（经白念珠菌刺激