微生物的培养与应用

1、课题1 1 微生物的实验室培养 了解有关培养基的基础知识，进行无 菌技术的操作，进行微生物的培养。 一、课题目标： 掌握培养基的制备、高压蒸气灭菌和 平板划线法等基本操作技术，熟练、规范 地进行无菌操作，成功地培养微生物。 无菌技术的操作。 二、课题重点和难点： 三、技能目标： 课题1 1 微生物的实验室培养 一、基础知识 微生物: : 1.1.特点：结构都相当简单, ,个体多数十分微小. .通常要 用光学显微镜或电子显微镜才能看到，有的甚至没 有细胞结构. .且体内一般不含有叶绿素. .不能进行光 合作用. . 2.微生物包括五类 病 毒 细 菌 放线菌 真 菌 原生动物 菌落： 单个或少数

2、细菌在固体培养 基上大量繁殖时，就会形成 一个肉眼可见的，具有一定 形态结构的子细胞群体，叫 做菌落。 不同的细菌的菌落特征不同 菌落是鉴定菌种的重要依据 固体培养基：菌落，菌苔 1、定义 为人工培养微生物而制备的、提供适合微生 物生长、繁殖或积累代谢产物的营养基质。 2、分类 天然培养基 培养基中化学成分分： 合成培养基 半合成培养基 (二)、培养基 液体培养基 按物理形态分： 固体培养基 半固体培养基 、常用的固体培养基: 琼脂固体培养基. 、微生物在固体培养 基表面生长,可以形成 肉眼可见的菌落. 基础培养基 按培养基功能分： 选择培养基 鉴别培养基 选择培养基 加入青霉素的培养基: :

3、 分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基: : 分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: : 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基: : 分离自养型微生物 加入青霉素等抗生素的培养基: : 分离导入了目的基因的受体细胞 加入氨基喋呤、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷的 培养基: : 分离杂交瘤细胞 3、培养基内所含的基本物质 (1)、水 (2)、碳源 (3)、氮源 (4)、无机盐 (2)碳源 可作为碳源的物质有: 含碳无机物: 、 、 含碳有机物： 蛋白质 脂肪酸 返回 不同微生物所利用的碳源不同 异养型微生物的碳源为 自养型微生物的碳源为 碳酸盐碳酸氢盐二氧化碳 糖类（主要） 含碳有机物（

4、有机碳） 含碳无机物（无机碳） (3)氮源 可作为氮源的物质有: 含氮无机物： 、 、 、 含氮有机物： 蛋白胨 牛肉膏 尿素 返回 固氮微生物所利用的氮源是 氮气 氨气硝酸盐氨盐 氮气 (1)、pH值 如:培养霉菌需酸性、培养细菌需中性或微碱性 (2)、特殊营养物质- ? 如：培养乳酸杆菌需要在培养基中添加维生素 (3)、氧气的含量 如:培养厌氧微生物时需要提供无氧的条件 4、培养基内所需的其他条 件 生长因子 无菌技术包括的四大方面 1、对实验操作的空间、操作者的衣着和手，进 行清洁和消毒。 2、将用于微生物培养的器皿、接种用具和培养 基等器具进行灭菌。 3、为避免周围环境中微生物的污染，

5、实验操作 应在酒精灯火焰附近进行。 4、实验操作时应避免已经灭菌处理的饿材料用 具与周围的物品相接触。 返回 (三)、无菌技术 1、获得纯净培养物的关键: 2、无菌技术包括的四大方面 3、消毒与灭菌 (1)消毒： 概念：使用较为温和的物理或化学方法仅杀死物体 表面或内部一部分对人体有害的微生物。包括芽孢 和孢子吗？ 方法: 煮沸消毒法 巴氏消毒法:如牛奶的消毒 化学药剂消毒:酒精、氯气、石碳酸、煤酚皂溶液等 紫外线消毒 (不包括芽孢和孢子) 防止外来杂菌的入侵 （2）灭菌 概念：使用强烈的理化因素杀死物体内外所有的 微生物，包括芽孢和孢子。 方法：a 灼烧灭菌 b 干热灭菌 c 高压蒸汽灭 菌

6、 灼烧灭菌 微生物的接种工具 (接 种环、接种针)或其 他金属用具直接在火 焰的充分燃烧层灼烧 注意适用范围 干热灭菌 160170 ；12h 能耐高温的需要保持干 燥的物品( 玻璃器皿) 高压蒸汽灭菌 100kPa 121 15-30min 通常用于培养基的灭 以手提式灭菌锅最为常用 . 1.1.无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他 外来微生物污染外，还有什么目的？ 2.2.请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。 如果需要，请选择合适的方法。 （1 1） 培养细菌用的培养基与培养皿 （2 2） 玻棒、试管、烧瓶和吸管 （3 3） 实验操作者的双手 答：无菌技术还能有效避免操作者自身被

7、微生物感染。 答：（1）、（2）需要灭菌；（3）需要消毒。 思考: 1)无菌技术除了用来防止实验室的培养物被其他外来微 生物污染外，还有什么目的？ 2)消毒和灭菌有何不同？ 3)为什么消毒牛奶要用巴氏消毒法? 4)请你判断以下材料或用具是否需要消毒或灭菌。如果 需要，请选择合适的方法。 培养细菌用的培养基与培养皿 玻棒、试管、烧瓶和吸管 实验操作者的双手 消毒灭菌 条件温和强烈 作用 范围 物体表面或内部一部 分,不包括芽孢和孢子 物体内外所有微生物, 包括芽孢和孢子 无菌技术还能有效避免操作者自身被微生物感染。 灭菌 灭菌 消毒 营养成分不被破坏 二、实 验 操 作 制备牛肉膏蛋白胨固体培养

8、基 1.1.牛肉膏蛋白胨固体培养基配方 物质牛肉膏蛋白胨NaClNaCl琼脂水 重量5g5g10g10g5g5g20g20g 定溶至 1000mL1000mL 2.2.称量 按比例称取各种物质。 注意：牛肉膏要放在称量纸上称量，牛肉膏、蛋白胨 都易吸潮，称取时动作要迅速，称后及时盖上瓶盖。 3.3.溶化： 4.4.灭菌： 5.5.倒平板： 制备牛肉膏蛋白胨固体培养基 先将牛肉膏连同称量纸一起放入烧杯，加少量 水，加热至牛肉膏溶化并与称量纸分离后，用玻璃 棒取出称量纸。加入蛋白胨和氯化钠，用玻璃棒搅 拌使之溶解，再加入琼脂，搅拌，待溶解后，加水 定溶至100mL100mL。 将配制好培养基放到锥

9、形瓶中（瓶口加棉塞，包 上牛皮纸），连同培养皿（3 35 5套，用几层报纸包好） 一起放到高压锅内灭菌。 待培养基冷却到5050左右时倒平板。 倒平板操作的讨论 1. 1.培养基灭菌后要冷却到5050时倒平板。 用什么办法来估计培养基的温度？ 2. 2.为什么需要使锥形瓶的瓶口通过火焰？ 用手触摸锥形瓶，温度下降到刚刚不烫手 时即可开始倒平板。 通过灼烧灭菌，防止瓶口的微生物污染培 养基。 3.3.平板冷凝后，为什么要将平板倒置？ 4.4.在倒平板的过程中，如果不小心将培养基溅在 皿盖与皿底之间的部位，这个平板还能用来培养微生 物吗？为什么？ 平板冷凝后，皿盖上会凝结水珠，凝固后 的培养基表面

10、的湿度也比较高，将平板倒置， 既可以使培养基表面的水分更好地挥发，又可 以防止皿盖上的水珠落入培养基，造成污染。 空气中的微生物可能在皿盖与皿底之间的 培养基上滋生，因此最好不要用这个平板培养 微生物。 倒平板操作的讨论 纯化大肠杆菌 微生物接种方法常见的有平板划线法和稀 释涂布平板法。 1.1.平板划线法 通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划 线的操作，将聚集的菌种逐步稀释分散到培养 基的表面。 在数次划线后可以分离到由一个细胞繁殖 而来的肉眼可见的子细胞群体称菌落。 1、为什么在操作的第一步以及划线之前都要灼烧接种 环？在划线操作结束时，仍然需要灼烧接种环？ 第一步灼烧接种环是为了避免接种

11、环上可能存在 的微生物污染培养物； 平板划线法的讨论 每次划线前灼烧接种环是为了杀死上次划线结束 后，接种环上残留的菌种，使下一次划线时，接种环 上的菌种直接来源于上次划线的末端，从而通过划线 次数的增加，使每次划线时菌种的数目逐渐减少，以 便得到菌落。 划线结束后仍然要灼烧接种环，能及时杀死接种 环上残留的菌种，避免细菌污染环境和感染操作者。 2.2.在灼烧接种环之后，为什么要等其冷却后再 进行划线？ 平板划线法的讨论 3.3.在作第二次以及其后的划线操作时，为什么 总是从上一次划线的末端开始划线？ 以免接种环温度太高，杀死菌种。 划线后，线条末端细菌数比线条起始处 要少，每次从上一次划线末

12、端开始，能使细 菌的数目随着划线次数的增加而逐步减少， 最终能得到由单个细菌繁殖而来的菌落。 2.2.稀释涂布平板法 2.2.稀释涂布平板法 将菌液进行一系列的梯度稀释，然后将不 同稀释度的菌液分别涂布到琼脂固体培养基的 表面进行培养。 在稀释度足够高的菌液里，聚集在一起的 微生物将分散成单个细胞，从而能在培养基表 面形成单个的菌落。 稀释涂布平板法操作过程分两个步骤: : 系列稀释操作 涂布平板操作 系列稀释操作 101102103104 105106 (1)(1)将分别盛有9mL9mL水的试管灭菌并编号。 (2)(2)用移液管吸取1mL1mL培养的菌液，注入第二支试管中， 轻压橡皮头，吹吸

13、三次使之充分混匀。 (3)(3)从10101 1倍稀释的试管中吸取1mL1mL稀释液，注入第三支 试管中，重复步骤2 2，直至到第六支试管。 涂布平板操作 (1)(1)将涂布器浸在盛有7070的酒精的烧杯中。 (2)(2)取少量菌液（不超0.1mL0.1mL），滴加到培养基表 面。 (3)(3)将沾有酒精的涂布器 在火焰上引燃，火熄 后冷却8 810s10s。 (4)(4)用涂布器将菌液均匀 地涂布在培养基表面。 2.2.稀释涂布平板法 涂布平板操作讨论 涂布平板的所有操作都应在火焰附近进行。 结合平板划线与系列稀释的无菌操作要求，想 一想，第二步应如何进行无菌操作？ 将接种后和未接种（作为对照组）的培养基 均放到3737的恒温箱中，培养121224h24h后观察并 记录结果。 应从操作的各个细节保证“无菌”。如: :酒 精灯与培养皿的距离要合适、吸管头不要接触 任何其他物体、吸管要