系统发育学论文.

1、恩蚜小蜂属部分种类28SrDNA及C01基因序列的分子进化和系统学研究专业：生物化学与分子生物学姓名：邢建晓学号：20141155摘要本文通过对恩蚜小蜂属部分种类 28S rDNA及C01序列进行分析，重建恩蚜小蜂属的部分种类系统发育关系。使用ClustalX1.81对来源于Genbank上的27种恩蚜小蜂属28S rDNA及C01序列片段进行了同源性比较，并利用MEGA 5.0软件计算碱基含量、颠换值、转换值、颠换比和遗传距离，采取相邻连接法、最 小进化法、最大似然法构建了恩蚜小蜂属的系统发育树。结果显示，恩蚜小蜂属 28SrDNA序列的保守位点为3,占总位点数的0.55%;序列变异位点为5

2、38,简约信 息位点为536,占序列总位点的99.1%,转换数为113,颠换数为237,碱基的转换 主要发生在TC间,转换的频率是颠换频率的0.48倍,由此可以认为恩蚜小蜂属的 28SrDNA的保守性较强。恩蚜小蜂属C0I序列的保守位点为1,占总位点数的0.15%;序列变异位点为680,占总变异位点的99.7%;简约信息位点为678。其中 转换数为99,颠换数为284,可见恩蚜小蜂属的C0I序列的变异率较高。关键词：恩蚜小蜂属 28SrDNA系统发育AbstractThis article an alysis 28S rDNA and C01 seque nee of En carsia,a

3、nd rec on struct the genus part of phyloge netic relati on ships of En carsia. Using ClustalX1.81 from of 27 Encarsia in Genbank compared 28 s rDNA and CO1 sequenee fragments.The homology and MEGA 5.0 software is used to calculate base content,transversion value, tran sformatio n, tran sversio n rat

4、io and gen etic dista nce.Tak ing the adjace nt connection method,minimum evolution method, maximum likelihood method to con struct the phyloge netic trees of the En carsia.Accord ing to the results of En carsia ,con servative sites of 28s seque nces is3,acco un ti ng for 0.55% of the total numbers;

5、Sequencemutation loci is 538, contracted and information site is 536, acco un ti ng for 99.1% of the seque nee of total, convert the nu mber is 113, Brita in is 237, the bases of the transformation occur between mainly in TC, the frequency of tran sformatio n is a tran sversio n of 0.48 times, which

6、 can be thought of En carsia of the 28s con servative is stron ger. The En carsia of C0I seque nee of con servative sites is 1, accounting for 0.15% of the total numbers ;Sequenee mutation sites is 680, accounting for 99.7% of the total variation sites.A simple information site is 678 which convert

7、the number to 99. Britain is 284, Encarsia genus C0I sequenee variati on rate is higher.Keywords: Encarsia 28SrDNA system development1前言-2 -1.1恩蚜小蜂属分类地位 -2 -1.2序列比对-2 -1.3系统发育树的构建方法 -2 -1.4本论文研究目的与意义 -3 -2步骤与方法-3 -2.1序列比对-3 -2.2计算遗传距离 -4 -2.3 序列特征分析 -5 -2.4系统发育树的构建 -5 -3结果与分析-5 -3.1 28SrDNA序列的分析 -5

8、-3.1.1 28SrDNA序列核苷酸的组成 -5 -3.1.2 28SrDNA序列的碱基替换情况分析 -6 -3.2 COI序列的分析-7 -3.2.1 COI序列核苦酸的组成 -7 -3.2.2 COI序列的碱基替换情况分析 -7 -3.3恩蚜小蜂属的系统发育分析 -8 -3.3.1用最大似然法(ML)建树-8 -3.3.2 用相邻连接方法(NJ)建树-10 -3.3.3 用最小进化法(ME)建树-12 -4小结与讨论-13 -5参考文献-14 -、八 、亠1刖言1.1恩蚜小蜂属分类地位恩蚜小蜂属(Encarsia Forster )隶属于膜翅目(Hymenoptera)、小蜂总科 (Ch

9、alcidoidea )、财小蜂科(Aphelinidae ),分布于世界各地。雌成虫外部形态 特征是恩赐小蜂分类的主要依据。恩蚜小蜂体浅色至深褐色或有斑纹。触角膝 状,8节,索节3-4节,棒节2-3节,索节与棒节上有条形感觉器。前胸背板窄小， 中胸背板发达，三角片前突，小盾片宽大于长，通常具2对刚毛和1对板状感觉 器。中胸盾中叶一般具6-12根毛,呈对称排列。每盾侧叶2-3根毛,每三角片1 根毛,两三角片间的距离大于一个三角片长度。后胸背板窄。并胸腹节横向，中间窄,两端各有一个气门。前后翅各一对，前翅亚缘脉较缘脉短，通常2根毛。 翅基室具4-10根毛。后翅窄小。足跗节5节,少数种类中足跗节为

10、4节。产卵 器稍微突出腹部末端。恩蚜小蜂属建立于1878年，目前全世界已知种类413种，是蚜小蜂科中最 大的一个属。恩蚜小蜂属是介壳虫和粉風的主要寄生蜂，少数寄生厨虫，某些种类的雄性也可寄生鳞翅目的卵，或者为重寄生。在属阶元分类上，恩蚜小蜂属是 小蜂科中异名较多、分类较难的1个属。迄今为止，恩蚜小蜂属已有413个种 被描述，但据估计还有较多的种类未被描述。种团分类系统是恩蚜小蜂属的种 分类鉴定的重要基础,目前,被描述的恩蚜小蜂属种类主要被分为26个种团,其中大多数种类包含在 aura ntii, i naron, lahore nsis, luteala, opule nta, parvell

11、a strenua 种团中，但仍有78个种未能归到相应的种团。1.2序列比对序列比对需要确定基因位点的同源关系，并分析序列中位点插入、缺失的过 程,是序列分析的基础。多序列比对结果不会绝对的正确，只是反映了在多大程度上序列之间的相似性关系。采用不同的比对方法和结果，所得到的系统发育树可能不同。目前，序列比对方法主要为手工比对和自动比对。但是，如果序列间的相似性低于50%我们无法进行手工比对。CLUSTAL X是目前最流行的自动 比对程序。自动比对过程中可以进行手人工调整。1.3系统发育树的构建方法系统发育树是用来概括各种生物之间亲缘关系的树状分支图形。进化树的 拓扑结构依靠的算法有独立元素法和

12、距离依靠法两类。独立元素法指进化树的 拓扑形状是由序列上的碱基的状态决定的，如ML ME距离依靠法指两两序列 的进化距离决定树的拓扑形状,树枝的长度表示进化距离，如:NJ、UPGMA目前 最常用的系统发育树方法主要有：邻接法、最小进化法、最大似然法。由于多 种因素会影响系统发育树的构建，因此具体分析时应使用多种方法来构建可靠 性更高的系统发育树。邻接法（NJ法）在距离建树中常用到，是建树最快的算法。这种方法在个人 计算机上可以一次性处理大量的序列信息，并且可以方便地进行自展检验。其建树的步骤是连续不断地在最孤立的两序列中插入树枝，并且保留树的终端。因此，巩固了最接近的一对序列，这个过程不断地被

13、重复。NJ法是一个完全基于 算法的建树方法，并且只得到一个进化树。NJ法可以满足于仅为了简单聚类的 分子鉴定,而不适用于研究物种的进化地位。最小进化方法（ME法）是通过把所有距离相对于进化树的路径长度的偏差极 小化，将进化树中双重距离的合适度极大化 ，根据进化路径长度的差异优化出 最短、最优的进化树。目前 ME法在构建系统发育树的研究中越来越流行。最大似然方法（ML法）是比对给定序列的每个碱基位点，计算其碱基频率，从 而得出似然值。通过位点的似然值计算得到整个树的似然值 ，因此似然值越高， 进化树越好。ML法会花费大量的计算时间，但其建树效果比NJ法、ME法要好。1.4本论文研究目的与意义恩蚜

14、小蜂属大部分种类是粉虱和介壳虫的重要天敌，对粉虱和介壳虫具有 很好的控制作用。本文对恩蚜小蜂属的27种序列进行比对和研究。研究结果将为恩蚜小蜂属的种类在害虫生物防治中的应用提供参考依据。本文以28SrDNA和COI的基因序列，利用生物信息学分析方法,探讨了恩蚜小蜂属的不 同基因的组成特点，构建了该属部分种类的分子系统发育关系，旨在解决一些 分类地位上有争议的种类，并希望为今后恩蚜小蜂属的分类研究提供分子生物 学方面的依据。2步骤与方法2.1序列比对本次研究所用数据均来源于 Gen Ba nk。从GenBank下载了恩蚜小蜂属的 28S及COI基因的序列，同时下载两种同源序列作为外群，序列信息见

15、表2.1表2.1恩蚜小蜂属的序列分析种名28S序列号COI序列号En carsia haitie nsisAY360217.1AY264343.1En carsia ni gricephalaAF254246.1AY264340.1En carsia perplexaAF254245,1AF223371.1En carsia qvercicolaAF254242.1KC870914.1En carsia luteaAF254241.1KC870907.1En carsia smithiAF254234.1KF017886.1En carsia inaronAF254231.1GQ423484.

16、1En carsia adustaAF254230,1AB715248.1En carsia acce ntsAF254228.1AB715246.1En carsia cibce nsisAF254227.1AB715244.1En carsia mi neoiAF254226.1AB715240.1En carsia perga ndiellaAF254223.1JX531620.1En carsia bimaculataAF254221.1noEn carsia meritoriaAF223367.1noEn carsia stre nuaAY518548.1FJ483848.1En c

17、arsia asterobemisiaeDQ830995.1noEn carsia scapeataDQ830992.1AF254237.1En carsia californicaAJ547625.1noEn carsia arabicaAJ536052.1noEn carsia tricolorAJ305302.1noEn carsia dicbroaAJ305301.1noEn carsia estrellaeAJ305330.1noEn carsia heratyiHQ731041.1noEn carsia irisJF750724.1JF750719.1Aphytis meli nu

18、sAF379902.1JQ083673.1Aphytis hispa ni cusAY635324.1JQ268913.1将原序列进行BLAST同源性搜索,且所有序列的同源性大于85%可以确定 所获得的序列均为恩蚜小蜂的目的基因序列。序列用 CLUSTAL软件直接比对， 调整序列同源区,使各序列长度相近。将结果保存为 FASTA格式文件,以备系统 发育树的构建。2.2计算遗传距离依据K2P双参数模型计算遗传距离，并由同一物种的各个个体的序列计算出种内平均遗传距离。2.3序列特征分析用MEGA5.C软件对恩蚜小蜂属28S COI两种基因的比对结果进行分析。 计算四种碱基 A T、C G的组成比例

19、、变异位点、保守位、碱基频率、简约 信息位点。2.4系统发育树的构建本试验采用最大似然法(ML)、最大简约法(ME)和邻接法(NJ) 3种建树方法, 并使用MEGA5.C软件对不同种类的恩讶小蜂的28S COI构建系统发育树。(1) ML法建树如果进化模型选择合理,ML系统发育树是与真实进化树最接近。具体步骤 为：在MEG肿打开待分析的后缀为.meg的文件，在Phylogeny的选项中选择构 建ML系统发育树。(2) ME法建树在用MEGA5.C软件构建ME树时,采用wME法对三个数据组进行建树。先指 定特定的外群,对28SrDNA数据组设置权重值为：转换/颠换=1:2;对COI数据集 设置权

20、重值为：转换/颠换=1:2,密码子三位点的权重值为:lst/2 nd/3rd =1:1:1。采用Bootstrap (Bootstrap=1000)检验。具体步骤为：在MEG冲打开 待分析的后缀为.meg的文件，在Phylogeny的选项中选择构建ME系统发育树。(3) NJ法建树基于K2P双参数模型的NJ树计算速度最快，并可以在个人计算机上处理大 量的序列，也比较容易进行自展检验。NGW非常适合不需要弄清物种进化地位， 只需要简单聚类的分子鉴定。具体步骤为：在MEG中打开待分析的后缀为.meg 的文件，在Phylogeny旳选项中选择构建NJ系统发育树。3结果与分析3.1 28SrDNA序列

21、的分析3.1.1 28SrDNA序列核苷酸的组成用MEGA5.C软件对恩蚜小蜂28SrDNA序列进行核苦酸组成的分析。结果显 示:序列全长为921个碱基，序列保守位点为3,占总位点数的0.55%;序列变异位点为538,占总变异位点的 99. 4%;简约信息位点为 536,占序列总位点的99.1%。碱基 A+T含量为 43.5%,C+G为 56.5%。表3.1 28SrDNA序列的碱基情况平均长度CVPiSTCAG5443538536224.826.218.730.3注:C:保守位点;V:变异位点;Pi：简约信息位点;S:自裔位点3.1.2 28SrDNA序列的碱基替换情况分析DNA序列的碱基替

22、换包括转换(si)和颠换(sv)两种形式，是衡量碱基进化的重要依据。由碱基替换情况分析可知，在恩讶小蜂28SrDNA序列中,碱基替换率较大,其中转换数为113,颠换数为237,转换的频率是颠换频率的0.48倍。碱基的转换主要发生在TC间，由此可以认为恩蚜小蜂的 28SrDNA的保守性较强。恩蚜小蜂属28SrDNA的种间遗传距离为1.039-4.172,平均种间遗传距离为2.807;其种内遗传距离为0-0.412,平均种内遗传距离为0.209。个体之间的种间遗传距离明显大于种内遗传距离的 10倍，与Hebert的研究结果一致。校正距离（下三角）和标准差（上三角）Encarsia_Forste0.

23、020.000.010.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.010.020.020.020.020.020.020.010.020.02Encarsia_haitie0.160.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.010.020.020.020.010.020.020.020.020.020.020.020.02Encarsia_nigric0.000.160.010.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.02

24、0.010.020.020.020.020.020.020.010.020.02Encarsia_perple0.090.160.090.020.010.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.010.010.020.020.020.020.020.020.010.020.02Encarsia_querci0.120.190.120.110.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.010.020.020.020.020.020.020.010.020.02Encarsia_lutea0.110.16

25、0.110.070.120.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.010.010.020.020.020.020.020.020.010.020.02Encarsia_smithi0.120.170.120.110.130.130.010.020.020.010.020.010.020.020.020.020.010.020.010.020.020.020.010.020.020.02Encarsia_inaron 0.140.180.140.130.130.140.100.010.010.020.020.020.020.020.020.020.020

26、.020.010.020.010.010.020.020.020.02Encarsia_adust0.150.190.150.130.150.160.120.030.010.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.010.010.020.020.020.02Encarsia_accen0.140.190.140.130.140.150.120.020.010.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.010.010.020.020.020.02Encarsia_cibce0.140.180.140.1

27、20.110.130.070.110.110.120.020.010.020.020.020.020.010.020.010.020.020.020.010.020.020.02Encarsia_mineo0.140.180.140.130.140.150.160.180.200.190.180.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.02Encarsia_perga0.150.180.150.150.130.150.070.110.130.130.080.170.020.020.020.020.020.020.010.0

28、20.020.020.010.020.020.02Encarsia_bimac0.150.200.150.130.150.140.150.170.190.180.160.180.170.020.010.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.02Encarsia_merito0.160.070.160.140.170.150.160.170.190.190.170.180.190.210.020.020.020.010.020.020.020.020.020.020.020.02Encarsia_strenu0.160.210.160.160.170.1

29、70.190.180.200.200.200.220.210.080.230.020.020.020.020.020.020.020.020.020.020.02Encarsia_astero0.100.150.100.060.110.010.130.140.150.140.130.140.150.140.150.170.010.020.020.020.020.020.020.010.020.02Encarsia_scape0.090.160.090.040.080.070.090.110.130.120.100.130.120.110.130.150.060.020.010.020.020.

30、020.020.010.020.02Encarsia_califor0.160.070.160.130.170.150.160.170.190.190.170.180.180.210.010.230.150.130.020.020.020.020.020.020.020.02Encarsia_arabic0.110.170.110.120.120.120.040.090.110.110.070.170.070.160.160.190.120.090.160.020.020.020.010.020.020.02Encarsia_tricolo0.160.220.160.150.150.150.1

31、70.190.200.190.190.120.180.180.210.230.140.140.210.180.020.020.020.020.020.02Encarsia_dichro0.160.200.160.150.140.160.120.040.060.050.120.200.130.190.180.210.160.130.180.110.210.000.020.020.020.02Encarsia_estrell0.150.190.150.150.140.160.120.040.060.050.120.200.130.180.180.210.150.130.180.110.210.01

32、0.020.020.020.02Encarsia_heraty0.140.170.140.140.130.150.080.120.130.130.080.170.040.170.190.200.140.130.190.070.180.130.130.020.020.02Encarsia_iris0.100.160.100.070.110.080.120.130.130.120.120.130.150.150.150.180.080.080.150.120.150.150.150.140.020.02Aphytis_melinus 0.250.300.250.230.230.260.240.25

33、0.260.260.260.270.250.270.300.290.250.230.300.260.270.270.260.250.240.02Aphytis_hispani0.210.270.210.200.200.220.230.230.240.230.230.220.240.260.250.270.220.200.250.230.240.240.240.240.200.173.2 COI序列的分析3.2.1 COI序列核苦酸的组成用MEGA5.C软件对试验所得的COI序列进行核苷酸组成的分析。结果显示： 序列保守位点为1,占总位点数的0.15%;序列变异位点为680,占总变异位点的 99

34、.7%;简约信息位点为678,占序列总位点的99.4%。碱基A + T含量为77. 2%; C + G 为 22.7%。3.2.2 COI序列的械基替换情况分析由碱基替换情况分析可知，在恩蚜小蜂属COI序列中,碱基替换率也较大，其中转换数为99,颠换数为284,转换的频率是颠换频率的0.35倍。碱基的颠 换主要发生在AT,由此可以认为恩姆小蜂属 COI序列的变异性较强。恩蚜小蜂 属COI的种内遗传距离为0.072-0.162,平均为0.117;其种间遗传距离为1.436-40547,平均为2.992。个体之间的种间遗传距离明显大于种内遗传距离 的10倍,与Hebert的研究结果一致。表3.3

35、28SrDNA序列的碱基情况平均长度CVPiSTCAG6821680678235.912.241.310.5注:C:保守位点;V:变异位点；Pi:简约信息位点表3.4恩蚜小蜂属 CO1基因基于 Kimura 2-parameter参数校正距离（下三角）和标准差（上三角）En carsia_haitie nsis0.010.030.030.030.030.030.030.030.030.030.030.030.030.030.03En carsia_ ni gricephala0.040.030.030.030.030.030.030.030.030.030.030.030.030.030.03

36、En carsia_perplexa0.750.750.030.030.000.030.030.030.030.030.030.020.030.030.03En carsia_qvercicola0.610.590.720.010.030.020.030.030.030.030.030.030.030.020.02En carsia_lutea0.620.610.720.040.030.020.030.030.030.030.030.030.030.020.02En carsia_smithi0.750.750.000.720.720.030.030.030.030.030.030.020.0

37、30.030.03En carsia_i naron0.640.620.720.110.130.720.030.030.030.030.030.030.030.020.02En carsia_adusta0.640.650.610.630.640.610.640.030.030.030.030.030.030.030.03En carsia_acce nts0.690.690.670.700.700.670.700.650.030.030.030.030.030.030.03En carsia_cibce nsis0.660.670.650.690.690.650.690.630.720.03

38、0.030.030.030.030.03En carsia_mi neoi0.720.700.740.700.710.740.710.700.740.690.030.030.030.030.03En carsia_perga ndiella0.680.670.720.680.680.720.650.670.700.680.740.030.030.030.03En carsia_scapeata0.730.730.160.700.710.160.720.570.650.640.740.720.030.030.03En carsia_stre nua0.610.610.680.640.630.68

39、0.680.640.710.650.670.690.670.030.03Aphytis_meli nus0.630.610.750.080.110.750.100.640.710.690.680.660.710.660.02Aphytis_hispa ni cus0.610.600.760.110.130.760.140.640.700.700.710.670.750.660.113.3恩蚜小蜂属的系统发育分析3.3.1用最大似然法（ML）建树100L Encarsia californica23Encarsia haitiensisEncarsia Forster14100Encarsia

40、nigricephala24Encarsia scapeataEncarsia iris152326Encarsia perplexa100一 Encarsia luteaEncarsia asterobemisiae48Encarsia smithi51Encarsia arabica80Encarsia pergandiella100Encarsia heratyiEncarsia cibcensis3297100Encarsia dichroaEncarsia estrellae179510010057Encarsia inaronEncarsia adusta99Encarsia ac

41、centaEncarsia quercicolaEncarsia bimaculata100Encarsia mineoiEncarsia strenuaEncarsia tricolorAphytis melinusAphytis hispanicus0. 05图3.1基于Kimura 2-parameter参数建立的恩蚜小蜂属28SrDNA的ML树70En carsia scapeata100101006610010025100En carsia perplexaEn carsia smithiEn carsia stre nuaEn carsia perga ndiellaEn cars

42、ia cibce nsisTetrigoideaAphytis hispa ni cusEn carsia qvercicolaEn carsia lutea59En carsia inaron66Aphytis meli nus62En carsia haitie nsis100En carsia ni gricephalaEn carsia acce ntsEn carsia mineoi图3.2基于Kimura 2-parameter参数建立的恩蚜小蜂属CO1的ML树3.3.2用相邻连接方法（NJ）建树Encarsia nigricephala100Encarsia bimaculata

43、Encarsia strenuaEncarsia haitiensis100Encarsia meritoria100Encarsia californicaEncarsia iris62425652Encarsia perplexaEncarsia scapeataEncarsia lutea1001- Encarsia asterobemisiaeEncarsia quercicola5088Encarsia smithiEncarsia arabica2394Encarsia pergandiella99Encarsia heratyi94Encarsia cibcensis100 Encarsia dichroa1- Encarsia estrellae100Encarsia inaron68Encarsia adusta99 1- Encarsia accenta99100Encarsia mineoiEncarsia tricolorAphytis melinusAphytis hispanicus0. 02图3.3基于p-distanee参数建立的28SrDNA的NJ树333用最小进化法（ME）建树0.05图3.4基于Kimura 2-parameter参