想做多重免疫荧光？收好指南-教你一张片子染出七种颜色

1、想做多重免疫荧光？收好指南，教你一张片子染出七种颜色想做多重免疫荧光？需要先思考这几个问题：问题1:你认得全动 物园里的动物们吗，比如大鼠，小鼠，兔，山羊，绵羊，鸡，荷兰猪（豚 鼠）？不同种属的抗体需闹清楚。问题2：你确定能分得清字母表并做得 了十以内得加减法吗？有不同亚型鉴定的过的一抗，比如：IgGl , IgG2a, IgG2b , IgG2c , IgM , IgE不知道怎能行？问题3：你确定能将动 物和数字字母们对号入座，并找对门牌吗？有对应种属特异反应性的Fab二抗，比如：F （ab ） 2 Fragment（避免Fc反应性出现的非特异染色），Cross adsorbed （抗体纯化

2、过 程交叉吸附，避免物种交叉反应带来的背景）。问题4：你确定能将重 峦叠嶂移出两山排两吗？选择合适的荧光素，明辨激发光和发射光，且不 会导致荧光背景增强，比如：FITC、PE、Cy、Alexa Fluor、DyLig ht o就算上面的问题你都能搞定，订购来了各种试剂，准备来了片子， 你就一定能染出来多重颜色？你只是迈开了万里长征的第一步而 已。因 为要得到理想的荧光实验结果，每一个步骤都需深（w 度（k mg）优（m化（罚，固定通透方法、浓度配比、抗体共孵育、抗体稀释液、封 闭条件等等。此时，有人在你发际线还没有升高，头发还乌黑浓密的时候， 在你的耳边悄悄跟你说：做多重荧光简单，有种快捷省时

3、的方法。先让你 们随意感受一下这种方法染出来的图片：接下来我们将仔细介绍该方法实 验原理和实验步骤。多重荧光免疫组化（mIHC ）实验原理上述方法采用TSA技术（Tyramide Signal Amplification?,酪胺信号放大技术）:简单来说，用该方 法做多重免疫荧光是利用二抗上带有的HRP （而不是直接偶联荧光素）， 来催化后续添加入体系的非活性荧光素。荧光素在HRP和过氧化氢的作用下被活化，跟临近蛋白的酪氨酸残基共 价偶联，使得蛋白样品与荧光素稳定结合。然后微波处理，前一轮非共价 结合的抗体被洗掉，共价结合的荧光素还留存在样品上。再换个一抗来第 二轮孵育，周而复始。等到所有抗体孵

4、育结束，荧光素都结合好后，最后 去检测结果。由于每次体系中都只有单一抗体孵育，因此无需担心抗体 交叉反应，以及一抗二抗种属匹配问题，大大减少了实验设计时不同种属 抗体选择匹配的限制。也就是说，如果用TSA技术，同一张片子上所有 的靶标都可以选用特异性高的兔单克隆抗体。搭配同一支抗兔的HRP二 抗就可以进行实验，而且信号放大的倍数大大增强。荧光法多重免疫组 化，可同时进行五个颜色通道以上，这种情况下发射光谱会重叠，我们可 以借助多光谱成像系统来解决这个问题。这是传统间接荧光法染色和显色 法多重免疫组化所做不到的。而且还能真实反映关键蛋白的表达情况和相互之间的关系，从而极大地节约珍贵的样品使用TS

5、A技术，你需要准备：1. 严格验证的高特异性抗体：所有CST的IHC-P验证过的抗体都满足mIHC （多重荧光免疫组化）高特异性的要求。2. HRP偶联的针对一抗种属亚型特异的二抗。3. 酪胺荧光素（PerkinElmer, Thermo Fisher Scientific 等供应商）o4. 多光谱成像系统(PerkinElmer等)。四事具备，你就可以开始尝试 进行TSA的多重荧光组化染色了。好炫的mIHC结果，比如：或者：如 何做到呢？除了优质的抗体，还需要优化的实验方案和抗体配比，比如: 如何配比抗体，如何选择荧光素等。CST研发科学家利用CST的优质抗 体，在这个领域也花了很多功夫来尝

6、试，强大的研发团队目前已经将已 有方案优化到了 7色！所以荧光染色染出七色光再也不是传说，七色光 不是传说，不是传说！而且实验方案、抗体配比全部免费开放给大家， 免费开放，免费！下面容我直接带你们收获一下胜利果实吧，请看优化好 的多重荧光免疫组化(mIHC )实验操作步骤：多重荧光免疫组化(mIHC )实验操作步骤首先，我们来解读一下CST采 用的基于TSA的mIHC实验优化原则，我们以人浆液性卵巢癌的石蜡切 片样本染 PD-L1、B7-H4、FoxP3、CD8alpha 和 CK 的 mIHC 优化流程为例介绍如何优化。基本方法1.切片脱蜡、复水2.抗原修复：优化抗原修复流程，尽可能最大程度

7、 修复抗原。3.抗体浓度优化：染色前优化抗体稀释度，提高每一个靶点 的检出率和信噪比。4.染色：用SignalStain? Antibody Diluent #8112 稀释一抗，然后用对应的 SignalStain? Boost IHC Detection Reagent (HRP , Mouse) #8125 或 (HRP, Rabbit) #8114 作 为二抗孵育，使用荧光素反应染色。5.拍照分析：用Nuance?多光谱 成像系统(PerkinElmer公司)拍摄，也可使用其他多光谱成像系统如Vectra?, Mantra?等，并用配套 inForm? Tissue Finder?模式

8、识别软件进行成像分析。流程优化1.抗体稀释优化多重染色之前，先摸索单通道下每一个单抗的最佳浓度范围。以PD-L1抗体为例，通过梯度稀释抗体，测试阴性(PC-3)和阳 性(Karpas-299)样本的荧光强 度，计算信噪比(S/N )和最高荧光强度(以每细胞平均荧光强度表示)同时能满足的稀释比例/范围。图中1： 1400是荧光强度较强的情况下，信噪比可接受的最佳点。在更高的信噪比测试点中，平均荧光强度降低较明显，使得其他测试点变为次佳选择。 强烈建议在多重染色之前先进行这种单通道测试以达到最佳效果。2.抗体-荧光素匹配多重染色需要平衡待检样品中靶点峰度和各通道 信号强度。通过此步矩阵式优化尽量做

9、到：寡靶配强光，众靶配弱光。下 图中PD-L1搭配Cy3?的荧光信号最强，但信噪比低。FITC信噪比 高，但荧光强度弱。Cy5?综合来看能达到二者的平衡，因此最适合搭 配PD-L1 o 3.染色顺序优化TSA原理的多重荧光免疫组化中，由于染 料是依次共价偶联在切片上的，并需要通过加热洗去前续抗体，因此需 要确定染色顺序，以保证：A.多次加热切片不会影响后续靶点表位完整 性；B.前续偶联的荧光素能耐受后续加热过程。基于以上荧光素染色 要点，我们可以将原来确定染色顺序的排列问题=120种情况，简化成5 x 5=25优化测试方案。针对每一个抗体-荧光素匹配通道，根据以下 表格 来进行摸索：例如，分别

10、针对每一个抗体进行如下测试：第一位染 色顺序的测试中，切片PD-L1抗体孵育，Cy5?染色 前已经进行了抗 原修复加热一次；在孵育之后，再微波加热处理5次。第五位染色顺序 的测试中，切片PD-L1抗体孵育之前，微波加热5次，孵育之后，然 后再微波加热一次。这样的测试矩阵能够测定抗体、荧光素的结合能力和 稳定性。从下图结果可以看出：染色顺序越早Cy5?荧光信号越弱， 信噪比是在第1和第5位最低。信噪比最高的是将PD-L1安排在第2和 第4位。如果同时考虑其他的抗体-荧光素配对，则将PD-L1和Cy5? 安排在第2位最佳。4.构建多光谱库在多色模式下，每一靶点自身产生的荧光素信号和同一组 合中其他

11、相关荧光素产生的信号同时被收集构建一个光谱库，进行线性 分离分析。简单来讲，需要让分析软件认识多色模式中每一个荧光素的发 射光谱，从而将针对特定靶点的真实信号同其他荧光素产生的信号区分开。 并将每一个荧光素信号附以伪彩，黑色伪彩被定义为样本自发荧光，则可 以在最后图像采集和处理时将信号减掉。5.单通道和多通道信号对比为 了进一步优化和理解多通道染色对真实信号的影响，可以进行多色和单色 染色的对比。为避免处理的差异，所有的切片都进行了同样的加热和冷却 处理。从图中可以看出5色中的4色有不同程度的平均荧光强度降低， 可能的主要原因是抗原遮 蔽，即前续TSA反应干扰了后续的抗原抗 体结合。6.显色法和荧光法对比进一步比较不同原理的染色方法，确 定验证不同靶标表达范式和表达量的真实性。图中非连续切片，视野不 同。请留意箭头处的表达位置。7.多通道染色（5个靶点+核复染）此组合能够展现出肿瘤上皮细 胞（CK ）、肿瘤微环境和肿瘤浸润淋巴细胞的空间关系，可以为PD-L1疗法和肿瘤免疫评分提供重要参考。结论TSA技术下多重荧光免疫组化相比传统的多重荧光而言，具有：信号放 大倍数高、简化抗体选择、易于设计优化、超多通道同时检测、全景展 示蛋白表达特征、节约样品等诸多优点。而且CST所有IHC-P验证过 的抗体都可以用在这类应用中，随着技