植物微小核糖核酸mRNA

1、植物微小核糖核酸 （microRNA） 对于中药、天然药物药效 物质基础和质量控制研究的重要意义探讨 by14211 微小核糖核酸（ microRNA ） 1.1 定义 MicroRNA （miRNA ）是一种长约 22 个核苷酸的单链小分子 RNA ，本身不编码蛋白 质，但能够通过与靶 mRNA 特异性的碱基配对引起靶 mRNA 的降解或者抑制其翻译对基因 进行转录后表达的调控， 调节细胞功能， 属于表观遗传学范畴。 人体大约有 1000 余种 miRNA ， 这些 miRNA 可以调控 20%-30% 的基因表达，从而调节人体生长、发育、生理和病理等过 程。 RNA。一般的前体RNA经加工

2、后是对称的， 而另一部分前体 RNA 加工后 ,双链 RNA 只有一条链稳定而形成单链，即 的 miRNA 在 miRNP /RISC 作用下，可以与成熟 而抑制基因转录和 （或）使 mRNA 降解而抑制基因表达。 区的特殊位点结合抑制其翻译过程，从而调控基因表达。 1.2 作用机制 细胞内约 70 个核苷酸的茎环结构或双链 内切酶 Dicer 作用下，形成具有特定结构特征 RNA 分子前体转录物在双链 RNA 特异性核酸 （双螺旋 ）和一定长度 （ 21 22个核苷酸 ）的小 产生21 25个核苷酸的双链 RNA，即siRNA。 miRNA ；所形成 mRNA 上任意与之互补的序列相结合，从

3、 miRNA 只与它们靶基因 3 端非翻译 1.3 特点 （1） 广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA ，它本身不具有开放阅读 框架 （ORF） ； （2）70 %的哺乳动物 miRNA 基因是位于 TUs 区 （3） 通常的长度为1825 nt，但在3 端可以有12个碱基的长度变化; （4） 成熟的miRNA 5 端有一磷酸基团，3 端为羟基，这一特点使它与大多数寡核苷酸和 功能 RNA 的降解片段区别开来；多数 miRNA 还具有高度保守性、时序性和组织特异性。 1.4 生理功能 在各类小分子 RNA 中， miRNA 具有最广泛的基因调节功能，它能对基因活动（生长、 分

4、化、凋亡及应激反应等 )的各个层面进行调节。 miRNA 的靶基因一般为动植物中发育基因， 如在植物中 , 控制分裂组织同一性的转录因子就是 miRNA 的一个靶点，表明 miRNA 在控 制生物发育方面有不容忽视的作用。 miRNA 可参与生命过程中的一系列重要进程，包括早 期胚胎发育、细胞增殖、细胞凋亡、细胞死亡、脂肪代谢，甚至可通过 miRNA 途径调节干 细胞的分化。 miRNA 序列、结构、丰度和表达方式的多样性， 使其可能作为 mRNA 编码蛋 白质的调节因子，对基因表达、细胞周期调控乃至个体发育产生重要影响。总之，miRNA可 能在基因表达调控领域中起着非常重要的作用。 此外 ,

5、miRNA 还与人类癌症的发生、 发展有 密切关系。 1.5 临床应用 国际上已有企业研发 miRNA 的拮抗剂，拟用以治疗心肌梗塞 ( 抗 miRNA-15 、抗 miRNA-195) 、纤维化 ( 抗 miRNA-21) 、动脉硬化 ( 抗 miRNA-33) 、丙型肝炎 ( 抗 miRNA-122) 、炎症 ( 抗 miRNA-155) 、肿瘤 ( 抗 miRNA-21) 、真性红细胞增多症 ( 抗 miRNA-451) ; 研发 miRNA 的补充剂，拟用于治疗恶性肿瘤 ( miR-16、 miR-34) 、肺癌 ( let-7) 、前列腺癌 ( miR-23a) 和心肌纤维化 ( m

6、iR-29) 。 二学者研究成果 成都中医药大学王米渠、韩玉萍用 miRNA 芯片探讨糖尿病肾虚血瘀证患者的 miRNA 表达差异，发现糖尿病候迭差异 miRNA 3 条( 其一为 miR-32) ，肾血血瘀证候选差异 miRNA 2 条。潘运宝等用 miRNA 芯片探讨了小柴胡汤体外对低分化鼻咽癌 CNE-2 细胞的 作用，发现在被检测的 326 个 miRNA 中，有 10 个上调、 1 个下调，其中差异较显著是 miR-513，miR-498，miR-210和miR-602。冯明光、莫寅元、江琼用西洋参提取物体外处理 人乳腺癌 MDA-MB-231 细胞，随着细胞增殖的抑制，有 miR-

7、145， miR-205 表达升高、 miR-196a 表达的下降。骆丹，周炳荣发现黄芩苷能减轻紫外线照射小鼠皮肤所致光产物和 炎症反应的同时， 可使 1 个 miRNA 上调、 3 个下调， 这些差异表达 miRNA 的靶点与 DNA 损伤修复通路相关。 方中英等探讨了王不留行增乳活性单体邻苯二甲酸二丁酯对牛泌乳中期 乳腺上皮细胞 miRNA 表达的影响，发现它能抑制 miR-21 表达以外，也与催乳素一样能抑 制 miR-143， miR-125， miR-195 等的表达。 国际著名的 Nature 杂志近日介绍了南京大学张辰宇教授的研究团队 10月 7日在 Cell Research

8、杂志上发表的最新发现：一种植物微小核糖核酸 (microRNA) ，MIR2911 直接靶 向甲型流感病毒 (IAV) ，包括 H1N1 ， H5N1 和 H7N9 。而在金银花中富含这种微小核糖核酸。 给小鼠饮用金银花汤剂，可预防其感染IAV ，并降低 H5N1 导致的小鼠死亡率。该发现的重 要意义还在于：率先确定了 MIR2911 为直接靶向甲型流感病毒的活性成分；首次证实自然 产物能直接靶向病毒，因此， MIR2911 有可能作为 “病毒界青霉素” ，直接用于对抗多种 病毒；证实金银花煎剂中的 MIR2911 生理浓度足以对抗甲流病毒；这些结果还能支持他们 先前的一项发现， 外源性的 m

9、icroRNA 通过饮食， 可被哺乳动物胃肠道有效地吸收， 并能跨 界地起到重要的调控作用；进一步证实外源性小 RNA 可通过饮食进入动物体内，运送至各 组织，且浓度足以产生生理功能。本研究具体内容如下： 流感A病毒，特别是H1N1, H5N1和H7N9威胁着全世界人类的健康。这里，我们报道 microRNA2911，这是一种金银花编码的非规则的microRNA,能直接定向作用于一系列的流 感A病毒。MIR2911在金银花的汤剂中高度稳定，小鼠持续给药金银花汤剂在外周血液及肺 部都能表现出高水平的 MIR2911。生物信息学预测或荧光素酶指示剂分析显示MIR2911能靶 向定位多种lAVs，包

10、括H1N1, H5N1,和 H7N9合成的MIR2911显著抑制 HINI编码的PB2和 NS1蛋白表达，但是对MIR2911结合的核苷酸序列改变中的突变体没有影响。合成的MIR2911, 从汤剂中提取的 RNA和汤剂都显著抑制 H1N1病毒复制，减少病毒感染引起的小鼠体重减轻， 但是对存在MIR2911结合的PB2和NS1核苷酸序列中突变体的突变体病毒引起的感染没有影 响。重点是，汤剂对病毒复制的抑制作用被一种抗MIR2911的抑制剂消除，这说明 MIR2911 在汤剂中的生理学浓度能直接充分的抑制H1N1病毒复制。MIR2911同样能体内外抑制 H5N1 和H7N9病毒的复制。另外，给药M

11、IR2911和汤剂显著减少小鼠感染 H5N1的死亡率。结果说 明, MIR2911 是中药中第一个鉴定为直接靶向于系列 IAVs 的活性成分,这将是有效抑制病 毒感染的新型天然产物的一个代表。 1. 小鼠给药金银花汤剂或合成的 MIR2911 后,植物性 MIR2911 被吸收,并转 移到肺部。 1.1 MIR2911 的稳定性 所有金银花中的短 RNA碎片（v 30nt）都经过分析。结果显示，金银花中包含一种特殊 的miRNA碎片（GEO号: GSE55268。总共从9676848个总序列中获得 148个miRNAs的562230 个序列片段。有 26个miRNAs多于100个序列片段。 在

12、这些植物 miRNAs中，MIR166g具有 高度的拷贝数（222051）。双蒸水煎煮金银花 30分钟得到汤剂（最终浓度为 0.2g 金银花 /ml ）, 接着进行RNA短序列分析。序列分析显示许多在金银花中能检测到的miRNAs都在煎煮过程 中减少，而 MIR2911例外，而且在最终的汤剂中MIR2911占有miRNAs序列的七成以上。金 银花中两种高表达的 miRNAs MIR166g和MIR2914,在汤剂中其拷贝数分别由 222051和25422 降低到315和706。为确认序列分析结果， 我们进行了 RT-qPCR分析及Northern blot分析。 RT-qPCR分析结果显示金银

13、花中 MIR2911的浓度是0.34pmol/g，而汤剂中MIR2911的浓度是 （0.2g 金银花 /ml）0.06pmol/ml （图 1C）。参考合成 MIR2911 的浓度（图 1D） northern 印 迹法结果证实 MIR2911在金银花和汤剂（0.2g金银花/ml ）中的浓度分别是0.4pmol/g和 0.08pmol/ml （图1D）。相较于其他 miRNAs或者小型 RNA碎片，MIR2911在制备汤剂的过程 中更耐煮。为证实 MIR2911的高稳定性，我们发现，MIR2911在核糖核酸酶作用后仍然大量 保持着片段完整。为证实 MIR2911的稳定性是否与其特殊序列5-GG

14、CCGGGGGACGGACUGGA-3 相关，我们进行了两个位点的突变，将5 -GG变为5 -AA,或者将3 -GGA变为3 -AAA。 这些突变体不能抵抗核糖核酸酶的作用，结果显示MIR2911的稳定性得益于其特殊的序列及 大量的GC碱基对。 Figure 1 (C)The concen tratio ns of MIR2911 in HS and HS decoction determi ned by RT-qPCR. (D)Northern blotting analysis showing MIR2911 expression in 10 g of HS or 10 ml of HS

15、decoction (final concentration: 0.2 g HS/ml). 1.2小鼠胃肠道对MIR2911的吸收 小鼠灌胃500卩l的汤剂来测定药物吸收(MIR2911浓度：0.12pmol/ml )。小鼠血浆内 MIR2911的基本浓度为 242 23.8 fM , 3小时后升高到 517.1 133.6 fM , 6小时后达到 峰值时浓度为1189.2 323.1 fM , 12小时降低到923 189.3 fM (图1E)。图1F显示给药 后，MIR2911水平在小鼠肺部持续上升，六小时达到峰值水平，接着降低，十二小时降低到 环境中的质膜囊泡。能够转运大量生物活性分子能

16、够运载多种特异性Pr. miRNA和DNA勺片 段。近年来人们关注到细胞源 MVs作为细胞间一个新的分子通讯介质） 中检测出来，暗示汤 剂中的MIR2911最初由胃肠道吸收， 包裹于肠表皮细胞的微泡中， 最终分泌到循环液中。 免 疫沉淀数据显示衍生于小鼠外周血液的微泡中的多数MIR2911都与AG02吉合。 Figure 1 (MIR2911 concentration: 0.12 nM) by gavage (0 h, n= 30; other time point, n= 6). (F)MIR2911 kin etics in mouse lung tissue after adm ini

17、 strati on of 500 M of HS decocti on (MIR2911 concen tratio n: 0.12 nM） by gavage （n= 5）. 1.3 MIR2911吸收入血后血浆及肺部的浓度测定 小鼠持续给药汤剂三天（0.06pmol/ml , 4ml/d ），进一步测定血浆及肺部MIR2911的浓 度。给药无菌水的小鼠为空白组。小鼠给药汤剂后，其血浆内MIR2911的水平的提高了 3 倍（从250.5 38.8 fM至U 831.8 47.8 fM ）,然而空白组小鼠体内却没有观测到MIR2911 水平的变化（从 215.8 38.2 fM到253.3

18、26.3 fM）（图1G）。小鼠肺部的 MIR2911水平的 升高了 8倍以上，空白组小鼠仍然没有变化（图1H）。补充信息显示（图S4）肝内的MIR2911 水平升高了 10倍，但是肠道及肾脏里的浓度没有变化。肺部MIR2911浓度几乎与内源性 miR-25的浓度相当。MIR2911被胃肠道的摄取有待进一步通过小鼠给药合成的MIR2911来研 究（1nmol/ml , 100卩l ）。小鼠给药无菌水为空白组。图1I显示，三小时内血浆中MIR2911 水平由239.3 19.2 fM 增加到1655.7 246.8 fM，之后逐渐降低。十二小时后MIR2911血 浆水平降低到824.2 141.

19、7 fM。小鼠肺部 MIR2911水平也在持续上升，六小时达到峰值接 着降低。另外，小鼠体内MIR2911转移入肺的过程是由灌胃荧光标记的合成MIR2911来追踪 的（图1K）。 driinking HS decoction oontinyouslv (0.06-4 mvdayR 3 days) PltsmaH rv 二 GZIE-EcsMbu書 uoo二富E-x 0 00 *P H1N1 Mutant Mjiam viru4 MidM HutDwKClCm 4.植源性MIR2911体内外抑制 H5N1及H7N9病毒的复制，缓解接种H5N1所引起的致死 率。 4.1 MIR2911体外抑制H5

20、N1和H7N9病毒的复制 试验对象: MDCK田胞 HSN1, HS RNA Uh34h 运用HS煎剂中提取的RNA转染病毒后，病毒在细胞中的复制活动被抑制。用HS煎剂中 提取的RNA转染后log TCID50/ml，12小时时从 4.27 0.20 降至2.58 0.24 ； 24小时时 从7.49 0.06降至5.97 0.17，但是在运用了 MIR2911抑制剂后，这种抑制影响消失。 运用HS煎剂中提取的RNA转染病毒后，病毒在细胞中的复制活动被抑制。用HS煎剂中提取 的RNA专染后log TCID50/ml 。在12小时时 从4.17 0.08降至2.99 0.38，在24小时 时 从

21、6.24 0.04降至5.49 0.15，但是在运用了 MIR2911抑制剂后，这种抑制影响消失。 4.2 .MIR2911体内抑制HNi和病毒的复制 Po*tnftion K*畠T書 3* 在感染后5和7天，通过对比小鼠的肺部组织中的 fNi病毒浓度，发现服用 HS煎剂可 以有效减少其浓度 （5天log EID50从4.42 0.08 降至3.15 0.48 ; 7天从5.34 0.32 降至3.75 0.63 ），但是在运用 MIR2911抑制剂后，则这种效果消失。 再感染了 3日病毒后，HS煎剂及合成的 MIR2911对H2病毒复制过程的抑制作用开始 显现，肺部病毒浓度减少。 4.3 M

22、IR2911体内抑制HsNi和H2病毒引起的体重减少 H5U1, MS 矗如 * HdcI- t苗MJRen -Vim*hB 0K3KWD 1rjb*H3. DtazWr#An!fi4HR2 1 0 6IT1TTTTTII U 1 a ! 4 5 t 7 9 9 IQ 11 1： 1) U a丹 Post-lntiKticn & 争*1 .10 0 fa 1 3 3 4 6 i 7 9 U 11 13 19 U Days Pot-mfeewon 感染了 H5N1的小鼠以及运用ncRNA治疗的小鼠在7天试验后都明显的体重下降20% 服用合成MIR2911的体重减少情况明显好转（第9天减少不到10

23、%勺体重），而服用HS煎剂 的效果不明显，但是运用了MIR2911抑制剂后的情况是 HS煎剂不明显的效果也消失了。 感染了 H7N9的小鼠以及运用 ncRNA治疗的小鼠在8天试验后分别明显的体重下降30% 和20% 服用合成MIR2911的体重减少情况明显好转（体重减少不到20% ,服用HS煎剂的效果 相似，但是用了 MIR2911抑制剂后这种效果被阻碍。 4.4 MIR2911减少感染H5N1的小鼠死亡率 seo- H5N1 40- 晶- 20 wo HGCk Virus VifUS+ncFtNA Virus-MIR2911 Virus+HS EJecoctian V(fus+HS Decocti0ri+Anti-MIR2911 56789 Days PostIn faction 每组 8只小鼠，感染后第 9、10 天，分别死亡 3只小鼠 ，总体上，感染病毒的对照组 在试验结束后只存活 2 只 。 ncRNA则对于减少死亡率没有影响（在第 9、10、11和12天分别死亡了 2、3、1和1 只小鼠，试验结束全部死亡） 。 服用HS煎剂后明显降低感染病毒小鼠的死亡率（在第9天死亡2只，在试验结束后存 活6只）。但在同时使用了