高效液相色谱法精品课件

1、 目录目录 气相色谱只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有 机化合物，而hplc则适合于分析那些用气相色谱难以 分析的物质，例如挥发性差、极性强、具有生物活性、 热稳定性差的物质。现在，hplc的应用范围已经远远 超过气相色谱，位居色谱法之首。 hplc 分配色普法 离子色谱法 吸附色谱法 凝胶色谱法 高压输液泵、进样器、色谱柱、 检测器、数据系统 最基本组件 线脱气装置、梯度洗脱装置、自动 进样系统、柱后反应系统和全自动 控制系统等 配置组件 液相色谱仪的工作过程 1. 对输液泵的基本要求 恒压泵 恒流泵 工作方式 气动泵 机械泵 螺旋传动注射泵 单活塞往复泵 双活塞往复泵 往复式隔膜泵 2

2、. 输液泵 (1) 活塞型往复泵 优点：优点： 构造：构造： 双活塞往复泵 (2) 隔膜型往复泵 泡沫 为什么要脱 气 噪音峰 基线起伏 排气费时 荧光淬灭 ph变化。 图8-5 1. 为什么要进行梯度洗脱？ 2. 梯度洗脱操作 主要优点：主要优点： 主要缺点：主要缺点： 主要装置主要装置 特点 构成 色谱填料色谱柱管色谱柱 1.色谱柱的构成 图8-8 2. 色谱柱的填充 干法填充 湿法填充 3. 填料的结构 基质 功能层 3. 填料的物理结构 数据控制系统 自动控制单元 原理 固定相 流动相 基于被测组分在固定相表面具有 吸附作用，且各组分的吸附能力 不同，使组分在固定相中产生保 留和实现分

3、离。 固定相通常是活性硅胶、氧化铝、 活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体 吸附剂。 弱极性有机溶剂或非极性溶剂与 极性溶剂的混合物 吸附色谱在早期的hplc中应用得最多，现在， 很多以前用吸附色谱分离的物质被更方便和 更有效的化学键合相反相分配色谱所代替。 由于硅羟基活性点在硅胶表面常按一定几何 规律排列，因此吸附色谱用于结构异构体分 离和族分离仍是最有效的方法。如农药异构 体分离、石油中烷、烯、芳烃的分离。 原理 基于样品分子在流动相和固定相间的溶解度不同 键合固定相 以化学键合将功能分子结合到惰性载体上。 极性键合固定相 键合在载体表面的功能分子极性基团的有机分子 非极性键合固定相 键合在载体表

4、面的功能分子是非极性有机分子。 正相hplc 由极性固定相和非极性流动相所组成的hplc体系。 反相hplc 非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系 原理 1离子交换色谱法 检测器 液相色谱检测技术液相色谱检测技术 特点： 有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度 要比紫外检测法高2-3个数量级。而且所需样品量很小， 特别适合于药物和生物化学样品的分析。 1.超临界流体色谱超临界流体色谱 2.毛细管电泳和毛细管电色谱毛细管电泳和毛细管电色谱 3亲和色谱亲和色谱 定义：利用蛋白质或生物大分子等样品与固定 相上生物活性配位体之间的特异亲和力进行分离 的液相色谱方法。 固定相：将具有生物活性的配

5、位体以共价键结 合到不溶性固体基质上制得。 生物活性配位体：常用的有酶（如底物及其 类似物）、辅酶（如类固醇）、抗体（植物激素）、 激素（如糖和多糖）、抗生素（核苷酸）等。 3激光色谱激光色谱 原理 应用 检测 分离过程 首页 返回返回 目录目录 （3）高纯度。由于高效液相灵敏度高，对流动相 溶剂的纯度也要求高。不纯的溶剂会引起基线不稳， 或产生“伪峰”。痕量杂质的存在，将使截止波长 值增加50ioonm。 （4）化学稳定性好。不能选与样品发生反应或聚 合的溶剂。 (5)低粘度。若使用高粘度溶剂，势必增高压力， 不利于分离。常用的低粘度溶剂有丙酮、乙醇、乙 晴等。但粘度过于低的溶剂也不宜采用，

6、例戊烷、 乙醚等，它们易在色谱柱或检测器内形成气泡，影 响分离. ohsisocl2 clsi + hgbr si sinhch2chnh 2 h2 nch 2ch2 nh 2 ohsiclsir3 + sio (rosir 3) sir3+ hcl 这类键会固定相具有热稳定好，不易吸水，耐有机溶 剂的优点。能在70以下，ph=28范围内正常工作， 应用较广泛. 色谱中的保留行为。 20-3。 n ad n ad ad sx sx k 其中kad为吸附平衡常数，值大表示组分在吸附剂上保留强， 难于洗脱。kad值小,则保留值弱，易于洗脱。试样中各组分 据此得以分离。kad值可通过吸附等温线数据求

7、出。 rso 3 -h+ + m + rso 3 -m+ + h + 阴离子交换： rnr 3 + cl - + x - rnr 3 + x - + cl - 一般形式： r一ab rba r r ab ab ab k / 稳定，可使用小粒度固定相和高柱压来实现快速分离。 要电离度增大，就会使样品的保留增大。 k ab a - 水 相 + a -b+ 有 机 相 b + 有 机 相 水相水相 有机相 ba ba k ab 根据定义，溶质的分配系数 水相 水相 有机相 bk a ba k ab 1 水相 bk v v kk ab m s 酸阴离子交 换色谱 溶于水，离子与非离子反相离子对 色谱 3根据分子结构选择 用红外光谱法，可预先简单地判断样品中存在什么官能团。 然