常用生物化学检验技术

1、第第第第第第五五五五五五章章章章章章 常用生物化学检常用生物化学检常用生物化学检常用生物化学检常用生物化学检常用生物化学检 验技术验技术验技术验技术验技术验技术 第一节第一节 光谱分析技术光谱分析技术 第二节第二节 电化学分析电化学分析 第三节第三节 电泳技术电泳技术 第四节第四节 层析技术层析技术 第五节第五节 自动生化分析自动生化分析 技术技术 光谱分析技术是根据物质吸收或发光谱分析技术是根据物质吸收或发 射辐射能而建立起来的一类分析方法，射辐射能而建立起来的一类分析方法， 因不同分子的原子和原子团，其发射光因不同分子的原子和原子团，其发射光 谱和吸收光谱不同，而相同的物质在一谱和吸收光谱

2、不同，而相同的物质在一 定条件下，其发射光谱和吸收光谱的强定条件下，其发射光谱和吸收光谱的强 度与该物质的含量成正比关系。因此可度与该物质的含量成正比关系。因此可 对物质进行定性和定量分析，此类技术对物质进行定性和定量分析，此类技术 称为光谱分析技术。称为光谱分析技术。 光谱分析技术是一种最常用的生化检光谱分析技术是一种最常用的生化检 验技术，它主要包括：验技术，它主要包括： 吸收光谱分析：吸收光谱分析：可见、紫外、红外分可见、紫外、红外分 光光度法和原子吸收分光光度法光光度法和原子吸收分光光度法 散射光谱分析：散射光谱分析：散射比浊法和透射比散射比浊法和透射比 浊法浊法 发射光谱分析：发射光

3、谱分析：火焰光度法、原子发火焰光度法、原子发 射光谱法和荧光光谱法射光谱法和荧光光谱法 光是一种高速传播的电磁波，光的波长光是一种高速传播的电磁波，光的波长 （）的常用单位是纳米（）的常用单位是纳米（nm），可见光波长），可见光波长 400760nm，400nm称为紫外光，称为紫外光， 760nm称为红外光，波长愈短，能量愈大。称为红外光，波长愈短，能量愈大。 可见、紫外吸收光谱是由于多原子分子的可见、紫外吸收光谱是由于多原子分子的 价电子在电磁辐射的作用下，由基态跃迁到激价电子在电磁辐射的作用下，由基态跃迁到激 发态，这种因物质分子对辐射能的选择性吸收发态，这种因物质分子对辐射能的选择性吸收

4、 而得到的光谱称为而得到的光谱称为吸收光谱吸收光谱。 第一节第一节 吸收光谱分析吸收光谱分析 吸收光谱分析法包括可见、紫外、红吸收光谱分析法包括可见、紫外、红 外和原子吸收分析法。其中最常用的是可外和原子吸收分析法。其中最常用的是可 见光分析法，也被不严格地称为比色分析见光分析法，也被不严格地称为比色分析 法，准确的名称应是可见光分光光度法。法，准确的名称应是可见光分光光度法。 用于比色分析的光源与被测溶液的颜用于比色分析的光源与被测溶液的颜 色应为互补色。色应为互补色。 可见、紫外吸收光谱用于定量分析的依可见、紫外吸收光谱用于定量分析的依 据是据是光吸收定律光吸收定律，即，即lambert-

5、beer定律定律，它，它 是吸收光谱法的基本定律。是吸收光谱法的基本定律。 一、一、lambert-beer定律定律 1. lambert定律定律 当一束强度为当一束强度为io的单色光的单色光 透过某种吸光溶液后，由于溶液吸收了一部分光，透过某种吸光溶液后，由于溶液吸收了一部分光， 则透过的光线为则透过的光线为it。当。当溶液浓度不变溶液浓度不变时，透过的时，透过的 液层愈厚，则光线强度的减弱愈显著。液层愈厚，则光线强度的减弱愈显著。 it i0 用数学式表示为：用数学式表示为： 透光度随溶液厚度增加而减少，其关系透光度随溶液厚度增加而减少，其关系 是是透光度的负对数（透光度的负对数（lgt，

6、吸光度，吸光度a）与溶）与溶 液厚度成正比液厚度成正比，即，即 0 t i i t透光度透光度 lk i i i i ta t 0 0 t lglglg 2. beer定律定律 当一束强度为当一束强度为io的单色的单色 光透过某种吸光溶液后，若光透过某种吸光溶液后，若液层厚度不变液层厚度不变， 而浓度不同时，溶液的浓度愈大，则透过而浓度不同时，溶液的浓度愈大，则透过 光的强度愈弱，其定量关系光的强度愈弱，其定量关系a=kc。 当液层厚度不变时，吸光度与溶液浓当液层厚度不变时，吸光度与溶液浓 度成正比，这就是度成正比，这就是beer定律。定律。 3. lambert-beer定律定律 合并合并l

7、ambert定律与定律与beer定律可得定律可得 a=klc 说明吸光物质对单色光吸收的强度与物质的说明吸光物质对单色光吸收的强度与物质的 浓度和液层厚度成正比。浓度和液层厚度成正比。 吸光系数吸光系数k的物理意义是的物理意义是吸光物质在单位浓吸光物质在单位浓 度及单位厚度时的吸光度度及单位厚度时的吸光度，在给定条件下（波长、，在给定条件下（波长、 溶液性质、浓度）吸光系数是物质的特征常数，溶液性质、浓度）吸光系数是物质的特征常数， k值愈大，能测定的浓度值愈大，能测定的浓度c愈小，则灵敏度愈高。愈小，则灵敏度愈高。 二、比色分析仪器二、比色分析仪器 即可见光分光光度计，各类分光光度计即可见光

8、分光光度计，各类分光光度计 的结构和原理基本相同，一般包括光源、单色的结构和原理基本相同，一般包括光源、单色 器、吸收池、检测器和显色器五大部分。器、吸收池、检测器和显色器五大部分。 1. 光源光源 可见光常用钨灯，现用卤钨灯；可见光常用钨灯，现用卤钨灯； 紫外光常用氢灯。紫外光常用氢灯。 2. 单色器单色器 可用滤光片、棱镜、光栅。可用滤光片、棱镜、光栅。 3. 吸收池吸收池 (比色杯比色杯) 4. 检测器检测器 光电管或光电倍增管光电管或光电倍增管 5. 显示器显示器 指针式或数字式指针式或数字式 三、比色分析的特点三、比色分析的特点 1. 灵敏度高灵敏度高 被测定物质的最低浓度被测定物质

9、的最低浓度 一般为一般为10 5 10 6mol/l。 。 2. 测定快速、简便。测定快速、简便。 3. 应用范围广应用范围广 一些无色物质在一定一些无色物质在一定 条件下与显色剂反应，可生成有色物质。条件下与显色剂反应，可生成有色物质。 四、比色分析的定量方法四、比色分析的定量方法 （一）对比法（一）对比法 又称标准对比法，通常在测定未知浓又称标准对比法，通常在测定未知浓 度样品的同时，测定一已知浓度的标准液度样品的同时，测定一已知浓度的标准液 作比较，然后分别测定两者的吸光度。作比较，然后分别测定两者的吸光度。 as=klscs ar=klrcr 因测定成分相同，故因测定成分相同，故k值相

10、同，比色时用值相同，比色时用 同样规格的比色皿故同样规格的比色皿故ls=lr，所以比色分析中，所以比色分析中 测定标准液与未知液吸光度的比值也就等于其测定标准液与未知液吸光度的比值也就等于其 浓度的比值，即浓度的比值，即 若标准液与样品用量不等时，则再乘若标准液与样品用量不等时，则再乘 。 用对比法进行定量时，为了减少误差，选用对比法进行定量时，为了减少误差，选 用标准液浓度应尽可能接近待测样品浓度。用标准液浓度应尽可能接近待测样品浓度。 r s r s c c a a s s r r c a a c r s v v （二）标准曲线法（二）标准曲线法 配制一系列浓度不同的标准液，按一配制一系列

11、浓度不同的标准液，按一 定操作方法显色后，用选定的波长分别测定操作方法显色后，用选定的波长分别测 定它们的吸光度，然后以吸光度为纵坐标，定它们的吸光度，然后以吸光度为纵坐标， 标准液浓度为横坐标，在坐标纸上标出各标准液浓度为横坐标，在坐标纸上标出各 坐标点，通过连接各点，使其成一直线，坐标点，通过连接各点，使其成一直线， 即即a-c曲线。曲线。 a 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 2 4 6 8 10 12 c 注意事项注意事项 1. 测定条件发生变化时（如更换标准品测定条件发生变化时（如更换标准品 和试剂等），应重新绘制。和试剂等），应重新绘制。 2. 标准品应有高的纯度，标

12、准液的配制标准品应有高的纯度，标准液的配制 应准确。应准确。 3. 当待测液吸光度超过线性范围时，应当待测液吸光度超过线性范围时，应 将标本稀释后再测定。将标本稀释后再测定。 4. 标本测定的条件应和标准曲线制作时标本测定的条件应和标准曲线制作时 的条件完全一致。的条件完全一致。 用波长用波长200400nm的紫外光谱测定无的紫外光谱测定无 色物质的方法称为紫外分光光度法色物质的方法称为紫外分光光度法。芳香族。芳香族 类及含有共轭双键的烯烃、炔烃等不饱和烃类及含有共轭双键的烯烃、炔烃等不饱和烃 类，在类，在200400nm波长范围具备光吸收特性，波长范围具备光吸收特性， 故不需经显色反应就能直

13、接利用紫外分光光故不需经显色反应就能直接利用紫外分光光 度法测定，其选择性和灵敏度均高于比色分度法测定，其选择性和灵敏度均高于比色分 析法。析法。 （一）单组分测定原理（一）单组分测定原理 其基本原理与可见分光光度法相同，除可其基本原理与可见分光光度法相同，除可 采用前述的标准曲线法和对比法外，还可采用：采用前述的标准曲线法和对比法外，还可采用： 1. 吸光系数法吸光系数法 对于对于单一组分的纯物质单一组分的纯物质， 只要已知其摩尔吸光系数，测得吸光度（只要已知其摩尔吸光系数，测得吸光度（a） 后，可直接按下列公式计算物质的浓度。后，可直接按下列公式计算物质的浓度。 被测物体积被测物体积 反应

14、体系总体积反应体系总体积 l a c 例：例：已知维生素已知维生素b12的水溶液在的水溶液在361nm波波 长处的长处的为为28056，2ml维生素维生素b12的水溶液用蒸的水溶液用蒸 馏水稀释到馏水稀释到4ml，用，用1cm比色杯测得溶液的吸比色杯测得溶液的吸 光度为光度为0.414，求该维生素，求该维生素b12水溶液的浓度。水溶液的浓度。 lmol10952 2 4 128056 4140 l a c 5 /. . 被测物体积被测物体积 反应体系总体积反应体系总体积 （二）多组分混合物的测定原理（二）多组分混合物的测定原理 多组分指同一试样中含两种或两种以多组分指同一试样中含两种或两种以

15、上待测组分，测定时可根据各组分吸收光上待测组分，测定时可根据各组分吸收光 谱的重叠程度来确定定量方法。谱的重叠程度来确定定量方法。 1. 各组分吸收峰不相互重叠各组分吸收峰不相互重叠 按单组分测定方法按单组分测定方法 2. 各组分吸收峰相互重叠各组分吸收峰相互重叠 可采用解联立方程法，等收吸双波长可采用解联立方程法，等收吸双波长 法、系数光谱法。法、系数光谱法。 （一）火焰光度法（一）火焰光度法 是利用火焰使金属元素激发，能发射出是利用火焰使金属元素激发，能发射出 特征谱线的特点进行测定的一种方法。特征谱线的特点进行测定的一种方法。 1.基本原理基本原理 某些金属元素的基态原子某些金属元素的基

16、态原子 受到火焰激发后，其外层电子获得能量而从受到火焰激发后，其外层电子获得能量而从 基点跃迁到激发态，接着它们又以发射光谱基点跃迁到激发态，接着它们又以发射光谱 的形式释放出所获得的能量，而返回基态，的形式释放出所获得的能量，而返回基态， 在相同条件下，同一元素所释放的单位能量在相同条件下，同一元素所释放的单位能量 相同，故能形成固定光谱。相同，故能形成固定光谱。 如如钠钠发射光谱波长发射光谱波长589nm，钾钾发射光谱波发射光谱波 长长767nm。 由于火焰供给的能量不强，由于火焰供给的能量不强，只能激发只能激发碱碱 金属金属和和碱土金属碱土金属元素元素，生化检验中常用于钾、，生化检验中常

17、用于钾、 钠的测定。钠的测定。 元素的发射谱线强度与该元素浓度的关元素的发射谱线强度与该元素浓度的关 系可表示为系可表示为i=acb a是与试样组成，激发温度，激发电位有是与试样组成，激发温度，激发电位有 关的关的常数常数，b为为自吸收系数自吸收系数，当浓度很低时，当浓度很低时， b1，所以上式可写成，所以上式可写成i=ac，即发射谱线强度，即发射谱线强度 与测定元素浓度成正比。与测定元素浓度成正比。 2.干扰因素干扰因素 （1）共存元素的干扰）共存元素的干扰 共存元素产生的辐射干扰共存元素产生的辐射干扰 由于火焰由于火焰 使标本中其他元素激发，当发射时光谱接近，使标本中其他元素激发，当发射时

18、光谱接近， 甚至重叠时，可产生干扰，引起误差，如钙甚至重叠时，可产生干扰，引起误差，如钙 对锂、钠的测定干扰明显。对锂、钠的测定干扰明显。 阳离子的干扰阳离子的干扰 主要是通过对待测阳主要是通过对待测阳 离子的电离度产生影响，造成发射时强度的离子的电离度产生影响，造成发射时强度的 改变。改变。 阴离子的干扰阴离子的干扰 因阴离子可与某因阴离子可与某 些被测阳离子在火焰温度下形成仅能缓慢些被测阳离子在火焰温度下形成仅能缓慢 蒸发的化合物而抑制了原子激发，一般用蒸发的化合物而抑制了原子激发，一般用 释放剂来消除干扰，与干扰阴离子牢固结释放剂来消除干扰，与干扰阴离子牢固结 合。合。 （2）火焰对测定

19、的影响）火焰对测定的影响 火焰是激发光源，火焰的纯度和燃烧火焰是激发光源，火焰的纯度和燃烧 状态，稳定性，可直接影响分析结果的准状态，稳定性，可直接影响分析结果的准 确度，因此，要求所用燃料燃烧时火焰背确度，因此，要求所用燃料燃烧时火焰背 景色浅，温度高，无杂色。景色浅，温度高，无杂色。 （3 3）标准品的影响标准品的影响 由于生物样品中成分复杂，定量测由于生物样品中成分复杂，定量测 定中会互相干扰影响测定的准确性，所定中会互相干扰影响测定的准确性，所 以，如果以单纯的被测物质预制标准液以，如果以单纯的被测物质预制标准液 则与血清样品的结果相差甚远，故应使则与血清样品的结果相差甚远，故应使 用

20、血清作为标准以消除影响。用血清作为标准以消除影响。 （二）原子吸收分光光度法（二）原子吸收分光光度法 1. 基本原理基本原理 待测元素经原子蒸气发生待测元素经原子蒸气发生 器转化成气态原子（处于基态），由空心阴极器转化成气态原子（处于基态），由空心阴极 灯提供的待测元素的共振线经过待测元素的蒸灯提供的待测元素的共振线经过待测元素的蒸 气，共振辐射强度被蒸气中待测元素的基态原气，共振辐射强度被蒸气中待测元素的基态原 子吸收而减弱，其吸收规律遵循子吸收而减弱，其吸收规律遵循beer定律。定律。 共振线：共振线：电子从基态跃迁至第一电子激发电子从基态跃迁至第一电子激发 态的最低振动能级所吸收的谱线为

21、共振吸收线态的最低振动能级所吸收的谱线为共振吸收线。 简称为共振线。简称为共振线。 2. 应用应用 在医学检验中主要用于体液、在医学检验中主要用于体液、 毛发、指甲等组织钙、镁、铁、钠、锌、铝、毛发、指甲等组织钙、镁、铁、钠、锌、铝、 汞、铅、砷等多种元素的测定。汞、铅、砷等多种元素的测定。 优点：优点： 选择性好选择性好 受干扰少，原子吸收是光受干扰少，原子吸收是光 的窄带吸收，仅的窄带吸收，仅0.0010.01nm，而分子对光的，而分子对光的 吸收是宽带吸收，达几个吸收是宽带吸收，达几个nm。 灵敏度高灵敏度高 能测定能测定10 9 10 6g的元素。 的元素。 测定快速、简便测定快速、简

22、便 应用范围广应用范围广 只需更换不同空心阴极灯，只需更换不同空心阴极灯， 仪器昂贵。仪器昂贵。 （三）荧光分析法（三）荧光分析法 利用某些物质光致发光的特性，籍此对物利用某些物质光致发光的特性，籍此对物 质进行定性，定量分析的方法。质进行定性，定量分析的方法。 1.基本原理基本原理 某些物质的分子吸收了光某些物质的分子吸收了光 能，从基态跃迁至某一电子激发态中的某一振能，从基态跃迁至某一电子激发态中的某一振 动能级，处于激发态的振动能级中的分子通过动能级，处于激发态的振动能级中的分子通过 运动或与其他分子的碰撞而将吸收过多的能量运动或与其他分子的碰撞而将吸收过多的能量 输给其他分子，并返回到

23、第一激发态的最低振输给其他分子，并返回到第一激发态的最低振 动能级，同时发射荧光，跃迁到基态发射荧光，动能级，同时发射荧光，跃迁到基态发射荧光， 在一定浓度范围内，其荧光强度与溶液浓度呈在一定浓度范围内，其荧光强度与溶液浓度呈 线性关系。线性关系。 2.影响荧光强度的因素影响荧光强度的因素 （1）溶剂）溶剂 增大溶剂的极性，可时电子增大溶剂的极性，可时电子 跃迁的能量降低，荧光增强。跃迁的能量降低，荧光增强。 （2）温度、）温度、ph t分子碰撞频率分子碰撞频率， 因此荧光强度随温度升高而减弱。因此荧光强度随温度升高而减弱。ph可影可影 响化合物电离或使荧光物质水解，如苯胺响化合物电离或使荧光

24、物质水解，如苯胺 在在ph712溶液中主要以分子形式存在，溶液中主要以分子形式存在， 产生蓝色荧光，而在产生蓝色荧光，而在ph13的溶液中的溶液中 以离子形式存在，不能产生荧光。以离子形式存在，不能产生荧光。 （3）激发光和发射光）激发光和发射光 在定量测定时，在定量测定时， 一般应选择荧光物质的一般应选择荧光物质的最大激发波长最大激发波长（ex） 和和最大荧光波长最大荧光波长（em），但有些荧光物质，但有些荧光物质 化学性质不稳定，受激发光照射后易分解，化学性质不稳定，受激发光照射后易分解， 缩短样品照射时间，改变激发光波长。缩短样品照射时间，改变激发光波长。 （4）物质浓度的影响）物质浓度

25、的影响 荧光分析品适合荧光分析品适合 稀溶液，因稀溶液，因荧光物质浓度高，分子间碰撞增荧光物质浓度高，分子间碰撞增 加，使荧光强度减弱，这种现象称为自熄灭加，使荧光强度减弱，这种现象称为自熄灭， 自熄灭现象随浓度增加而增强。自熄灭现象随浓度增加而增强。 3. 仪器与测定方法仪器与测定方法 作为荧光分析作为荧光分析 的仪器有光电荧光计和荧光分光光度计的仪器有光电荧光计和荧光分光光度计 光电荧光计的结构与光电比色计很相光电荧光计的结构与光电比色计很相 似，不同之处是检测器与光线成直角，并似，不同之处是检测器与光线成直角，并 多一块滤光片。多一块滤光片。 如滤光片改为棱镜或光珊作单色器，如滤光片改为

26、棱镜或光珊作单色器， 就和可见紫外发光光度计相似而成荧光分就和可见紫外发光光度计相似而成荧光分 光光度计。光光度计。 仪器的组成部件的比仪器的组成部件的比 光源光源 单色器单色器 测定池测定池 光敏元件光敏元件 检测器检测器 光电比色计光电比色计 钨灯钨灯 滤光片滤光片 玻璃玻璃 光电池光电池 检流计检流计 (二面透光二面透光) 光电管光电管 光电荧光计光电荧光计 卤钨灯卤钨灯 滤光片滤光片 玻璃玻璃 光电管光电管 检流计检流计 (300700nm)两块两块 (四面透光四面透光) 检流计检流计 可见紫外可见紫外 钨灯钨灯 光栅或棱镜光栅或棱镜 分光光度计分光光度计 (400760nm) 玻璃玻

27、璃 光电管光电管 检流计检流计 氢灯氢灯 石英石英 光电倍增管光电倍增管 自动记录自动记录 (200400nm) 荧光分光荧光分光 氙弧灯氙弧灯 光栅或棱镜光栅或棱镜 玻璃玻璃 光电倍增管光电倍增管 自动记录自动记录 光度计光度计 (200700nm) 石英石英 氙弧灯发射的强烈紫外线对人眼有害。氙弧灯发射的强烈紫外线对人眼有害。 荧光分析优点：荧光分析优点： 灵敏度高灵敏度高 比可见紫外吸收光谱高比可见紫外吸收光谱高 103104倍。倍。 特异性强特异性强 通过选择合适的激发光通过选择合适的激发光 波长和荧光波长可避开其它物质干扰。波长和荧光波长可避开其它物质干扰。 操作简便、快速、重现性好

28、操作简便、快速、重现性好 样品用量少样品用量少 不足之处：不足之处： 应用范围有一定局限性应用范围有一定局限性，因许多物，因许多物 质不能产生荧光。质不能产生荧光。 对测定条件要求严格对测定条件要求严格，如试剂、溶，如试剂、溶 剂不应含有荧光物质。剂不应含有荧光物质。 仪器价格较贵仪器价格较贵 荧光分析法在医学检验中可用于测定荧光分析法在医学检验中可用于测定 类固醇激素（肾上腺皮质激素）及代谢产类固醇激素（肾上腺皮质激素）及代谢产 物，单胺类神经递质（儿茶酚胺，物，单胺类神经递质（儿茶酚胺，5-ht） 某些维生素（某些维生素（vita，b族）。族）。 电化学分析是一种以溶液电化学性质为电化学分

29、析是一种以溶液电化学性质为 基础测定物质含量的分析方法。基础测定物质含量的分析方法。按测定量的按测定量的 电化学参数的不同，可分为电化学参数的不同，可分为电位法电位法、电导法电导法、 库仑法、极谱法和库仑法、极谱法和伏安法伏安法等，下面主要介绍等，下面主要介绍 电位法中的离子选择电极法。电位法中的离子选择电极法。 是一种电化学敏感器，它的是一种电化学敏感器，它的电势与溶液电势与溶液 中给定离子的浓度的对数成线性关系中给定离子的浓度的对数成线性关系，故可，故可 以通过简单的电位测量，直接测以通过简单的电位测量，直接测 定溶液中离定溶液中离 子活度。子活度。 离子浓度与离子活度的关系离子浓度与离子

30、活度的关系 a=f.c 在稀在稀 溶液中（溶液中（10 4mol/l以下）活度系数接近 以下）活度系数接近1。 （ion selective electode ise） ise分析法的优点：分析法的优点： 1. 是一种直接的非破坏性分析方法是一种直接的非破坏性分析方法，可，可 反复进行，不受样品溶液颜色、浑浊等因素的反复进行，不受样品溶液颜色、浑浊等因素的 干扰。干扰。 2. 分析速度快分析速度快，单次分析通常只，单次分析通常只12min 3. 测量范围宽测量范围宽，45个数量级个数量级 4. 操作简便操作简便 5. 测量特定离子活度测量特定离子活度，对临床医学和基，对临床医学和基 础医学更有

31、实用意义础医学更有实用意义 ise大都大都属于膜电极属于膜电极，膜中含有与待测，膜中含有与待测 离子相同的离子。膜的内表面与具有相同离离子相同的离子。膜的内表面与具有相同离 子的固定浓度溶液接触，其中插入一内参比子的固定浓度溶液接触，其中插入一内参比 电极，当膜的外表面与待测离子溶液接触时，电极，当膜的外表面与待测离子溶液接触时， 引起膜电位的改变。由于电极膜材料、制备引起膜电位的改变。由于电极膜材料、制备 方法不同，使电板的稳定性、选择性和灵敏方法不同，使电板的稳定性、选择性和灵敏 度也不同。度也不同。 膜电位的产生：膜电位的产生：将电极插入待测离子溶将电极插入待测离子溶 液中时，由于离子的

32、交换和扩散作用，改变液中时，由于离子的交换和扩散作用，改变 了两相中原有的电荷分布，因而存在一定的了两相中原有的电荷分布，因而存在一定的 电位差，因为内充溶液中有关离子的浓度恒电位差，因为内充溶液中有关离子的浓度恒 定，内参比电极的电位固定，所以定，内参比电极的电位固定，所以ise的电的电 位（位（e）只随离子活度不同而改变，其电位）只随离子活度不同而改变，其电位 可用可用nernst方程式表示。方程式表示。 alg nf rt303. 2 ee 0 ise的的e值不能直接测定，必须将值不能直接测定，必须将ise 与参比电极浸入被测溶液中组成原电池，与参比电极浸入被测溶液中组成原电池， 然后通

33、过电动势来测定然后通过电动势来测定e值。值。 参比电极：参比电极：是指在温度、压力恒定的是指在温度、压力恒定的 条件下，当被测溶液离子浓度有所改变时，条件下，当被测溶液离子浓度有所改变时， 电极电位保持不变的电极。电极电位保持不变的电极。 离子选择电极离子选择电极 晶体膜电极晶体膜电极 均相膜电极均相膜电极 非均相膜电极非均相膜电极 刚性基质电极刚性基质电极 流动载体电极流动载体电极 非晶体膜电极非晶体膜电极 基本电极基本电极 气敏电极气敏电极 敏化电极敏化电极 酶电极酶电极 （一）晶体膜电极（一）晶体膜电极 其敏感膜为金属微溶盐，经加压成片，其敏感膜为金属微溶盐，经加压成片， 制成单晶、多晶

34、或混晶体电极敏感膜，如氟制成单晶、多晶或混晶体电极敏感膜，如氟 电极，其敏感膜为电极，其敏感膜为laf3单晶片。单晶片。 （二）非晶体膜电极（二）非晶体膜电极 1. 刚性基质电极刚性基质电极 其其敏感膜为玻璃敏感膜为玻璃，故，故 称为玻璃电极。成分一般为称为玻璃电极。成分一般为na2o-ai2o3- sio2改变这三种成分的配合比例，分别制出改变这三种成分的配合比例，分别制出 对对li+、na+、k+、ag+的离子选择电极。的离子选择电极。 2. 流动载体电极流动载体电极 其敏感膜是由溶解在与其敏感膜是由溶解在与 水不相混溶的有机溶剂中的离子缔合剂或混合水不相混溶的有机溶剂中的离子缔合剂或混合

35、 剂作为离子交换体，再将此溶液渗透在具有惰剂作为离子交换体，再将此溶液渗透在具有惰 性，微孔性和疏水性的塑料薄膜内。性，微孔性和疏水性的塑料薄膜内。 （三）气敏电极（三）气敏电极 是基于界面化学反应对气体敏感的电极，是基于界面化学反应对气体敏感的电极， 它是在一般的离子选择电极的基础上，再覆盖它是在一般的离子选择电极的基础上，再覆盖 一层疏水的透气膜（如聚四氟乙烯），如一层疏水的透气膜（如聚四氟乙烯），如co2、 nh3电极。电极。 （四）酶电极（四）酶电极 它由离子敏感膜和覆盖在表面含有酶的它由离子敏感膜和覆盖在表面含有酶的 酶涂层胶组成，敏感膜对待测物的酶促反应酶涂层胶组成，敏感膜对待测物

36、的酶促反应 有选择性响应，如尿素酶电极。有选择性响应，如尿素酶电极。 1. 响应范围及检测下限：响应范围及检测下限：响应范围是响应范围是 指电极对待测离子的响应符合指电极对待测离子的响应符合nernst式的线式的线 性区，此范围越宽越好，一般在性区，此范围越宽越好，一般在47个数个数 量级之间，检测量级之间，检测f限是指能够检测被检离子限是指能够检测被检离子 的最低浓度一般在的最低浓度一般在10-510-7mol/l。 2. 选择性选择性 是指电极对待测离子和共是指电极对待测离子和共 存干扰离子的响应程度的差异。存干扰离子的响应程度的差异。常用选择常用选择 性系数或选择比系描述，选择性系数越小

37、，性系数或选择比系描述，选择性系数越小， 表示电极选择性越强。表示电极选择性越强。 3. 响应斜率和转换系数响应斜率和转换系数 ise在在nevnet响响 应范围内被测离子活度变化应范围内被测离子活度变化10倍所引起的电报倍所引起的电报 电位变化的数值，即响应斜率（电位变化的数值，即响应斜率（s）。）。 从理论上说，从理论上说， 但对某一但对某一ise来说，实际来说，实际s值与理论值与理论s值并不完值并不完 全相符，其偏差用转换系数表示，一般转换系全相符，其偏差用转换系数表示，一般转换系 数达到理论值数达到理论值90以上的电极性能较好。以上的电极性能较好。 4. 电极寿命电极寿命 取决于电极制

38、作材料，结构取决于电极制作材料，结构 和使用保管情况。和使用保管情况。 nf rt303. 2 s 1. 标准曲线法标准曲线法 配制一系列不同浓度配制一系列不同浓度 标准溶液，测定其电位值标准溶液，测定其电位值es，绘制，绘制es-lgc 标准曲线，在相同条件下测定样品溶液电标准曲线，在相同条件下测定样品溶液电 位值位值ex。 2. 电极校正法电极校正法 用标准溶液校正用标准溶液校正ise， 制成直读式电仪表。制成直读式电仪表。 1. 电动势测量电动势测量，对于，对于一价离子一价离子的响应，的响应， 电势测量每差电势测量每差1mv引起浓度的相对误差为引起浓度的相对误差为4 ，对于，对于二价离子

39、二价离子则为则为8，因此对于测量，因此对于测量 电势的仪器精度要求达到电势的仪器精度要求达到0.1mv。 2. 温度温度 nernst公试中的斜率，内参比公试中的斜率，内参比 电极的电信号，以及离子活度等都与温度有电极的电信号，以及离子活度等都与温度有 关，因此在整个测量过程中应保持温度恒定。关，因此在整个测量过程中应保持温度恒定。 3. ph 溶液溶液ph值可影响被测离子在溶值可影响被测离子在溶 液中的存在形式，从而影响相应离子的活度，液中的存在形式，从而影响相应离子的活度， 如如laf3电极测定电极测定f 时，如 时，如ph5 ， f 则会 则会 生成生成hf，使结果偏低。，使结果偏低。

40、4. 滞后效应滞后效应 使用使用ise若先测浓溶液后，若先测浓溶液后， 再测稀溶液时电位平衡缓慢并出现误差，这再测稀溶液时电位平衡缓慢并出现误差，这 一现象称为一现象称为“滞后效应滞后效应”。 一、电泳的基本原理一、电泳的基本原理 （一）（一） 电泳的概念电泳的概念 溶液中带电颗粒在直流电场中向电荷相反溶液中带电颗粒在直流电场中向电荷相反 方向移动的现象称为电泳。利用电泳现象对物方向移动的现象称为电泳。利用电泳现象对物 质进行分离的技术叫电泳技术。质进行分离的技术叫电泳技术。 第三节第三节 电泳技术电泳技术 电泳技术的应用始于电泳技术的应用始于1937年，瑞典年，瑞典tiselius 利用界面

41、电泳将血清蛋白质分离成五种成分。利用界面电泳将血清蛋白质分离成五种成分。 1948年年wieland发明纸电泳，使电泳技术大发明纸电泳，使电泳技术大 为简化。此后，电泳技术发展迅速，特别是电为简化。此后，电泳技术发展迅速，特别是电 泳技术与层析法，免疫学方法的结合，使其分泳技术与层析法，免疫学方法的结合，使其分 辨率达到辨率达到 mg/ml水平，成为医学检验的一种重水平，成为医学检验的一种重 要分析技术。要分析技术。 （二）（二） 溶液中粒子的带电状态溶液中粒子的带电状态 蛋白质分子电离时蛋白质分子电离时有带正电荷的氨基有带正电荷的氨基，也，也 有电离有电离带负电荷的羧基带负电荷的羧基，故蛋白

42、质是一种两性，故蛋白质是一种两性 电解质。电解质。 在酸性条件下，羧基电离受抑制，在酸性条件下，羧基电离受抑制，nh2 -nh3 + 带带正电正电 在碱性条件下，羧基电离增强，在碱性条件下，羧基电离增强，cooh coo 带 带负电负电。 （三）（三） 电泳迁移率电泳迁移率 指带电粒子在单位电场强度作用下的指带电粒子在单位电场强度作用下的 电泳速度电泳速度，通常用，通常用表示表示 =v/e v为粒子移动速度（为粒子移动速度（cm/s）e为电场强为电场强 度（度（v/cm） 迁移率取决于带电粒子的性质（粒子迁移率取决于带电粒子的性质（粒子 所带电量所带电量q，粒子大小，粒子大小r形状）介质粘度形

43、状）介质粘度， 对于球状分子，根据对于球状分子，根据stoke定律定律 v= qe/6r u=q/6r 在实际测定中，电泳速度在实际测定中，电泳速度v以单位时间以单位时间t（秒）（秒） 内移动的距离内移动的距离d（厘米）表示（厘米）表示 v=d/t（cm/s） 电场强度电场强度e以单位长度以单位长度i（厘米）上所施加（厘米）上所施加 的电势差的电势差v（伏特）表示（伏特）表示 e=v/i（v/cm） 故故u=v/e=（d/t）/（v/i） =di/vt（cm2 /v.s） 通过测量通过测量d,l,v,t便可计算出颗粒的迁移率。便可计算出颗粒的迁移率。 由于不同的带电粒子其迁移率的不同，因由于不

44、同的带电粒子其迁移率的不同，因 此在同一电场中的移动距离不同，故能将其分此在同一电场中的移动距离不同，故能将其分 离，根据公式离，根据公式 d a=v.t/l a d b=v.t/l b a、b移动距离差为移动距离差为 d=( d a d b)=（ d a d b）v.t/l 分离距离与电压和电泳时间成正比，与支分离距离与电压和电泳时间成正比，与支 持物长度成正比。持物长度成正比。 二、二、 电泳的分类和电泳仪电泳的分类和电泳仪 （一）（一） 电泳的分类电泳的分类 1. 根据被分离样品的多少根据被分离样品的多少 分析电泳，制分析电泳，制 备电泳。备电泳。 2. 根据电泳电压的高低根据电泳电压的

45、高低 常压电泳，高压常压电泳，高压 电泳。电泳。 3. 根据是否使用支持介质根据是否使用支持介质 自由电泳，区自由电泳，区 带电泳。带电泳。 4. 根据电泳系统的组成是否均一根据电泳系统的组成是否均一 连续电连续电 泳，不连续电泳。泳，不连续电泳。 （二）电泳仪（二）电泳仪 由直流电源和电泳槽两部分组成。由直流电源和电泳槽两部分组成。 1、直流电源、直流电源 将交流电源经整流，滤波将交流电源经整流，滤波 后获得。分为后获得。分为 （1）恒压电源）恒压电源 电泳过程中的电压恒定不电泳过程中的电压恒定不 变。但电泳过程中的热效应，降低外周电路的变。但电泳过程中的热效应，降低外周电路的 电阻，使电流

46、慢慢增大。电阻，使电流慢慢增大。 （2）恒流电泳）恒流电泳 电泳过程中的电流恒定不电泳过程中的电流恒定不 变。用这种电流的输出电压可随外周阻力减少变。用这种电流的输出电压可随外周阻力减少 而减少，从而保持电流恒定。而减少，从而保持电流恒定。 （3）恒功率电源）恒功率电源 电泳中输出功率恒定不电泳中输出功率恒定不 变。主要用于等电聚焦电泳。变。主要用于等电聚焦电泳。 2.电泳槽电泳槽 盛装缓冲液和进行电泳分析的盛装缓冲液和进行电泳分析的 场所，一般用塑料和有机玻璃制成，它包括电场所，一般用塑料和有机玻璃制成，它包括电 极，缓冲液槽，电泳支架，透明盖组成。电泳极，缓冲液槽，电泳支架，透明盖组成。电

47、泳 槽的外形有水平式，垂直式，圆盘式等多种。槽的外形有水平式，垂直式，圆盘式等多种。 电极应具有良好的导电性，抗腐蚀性和抗电极应具有良好的导电性，抗腐蚀性和抗 电解作用。以铂金材料最为理想，最好贯穿整电解作用。以铂金材料最为理想，最好贯穿整 个缓冲液槽。个缓冲液槽。 三、影响电泳的因素三、影响电泳的因素 （一）缓冲液（一）缓冲液 维持电泳介质维持电泳介质ph恒定，并恒定，并 起导电作用。起导电作用。 1.组成组成 由弱酸和弱酸盐组成，常用的有由弱酸和弱酸盐组成，常用的有 磷酸盐，硼酸盐，巴比妥盐和三羟甲基氨基磷酸盐，硼酸盐，巴比妥盐和三羟甲基氨基 甲烷（甲烷（tris）等，其中巴比妥缓冲液用的

48、最多，）等，其中巴比妥缓冲液用的最多， 由巴比妥钠和巴比妥组成。由巴比妥钠和巴比妥组成。 选择缓冲液时应考虑的因素：选择缓冲液时应考虑的因素： （1）化学性能稳定，不易水解。）化学性能稳定，不易水解。 （2）缓冲液的）缓冲液的ph应与弱酸的应与弱酸的pk 值接近，有值接近，有 较强缓冲能力。较强缓冲能力。 （3）缓冲液中正负离子应有相近的迁移率，）缓冲液中正负离子应有相近的迁移率， 避免电晕出现正负离子分布不均。避免电晕出现正负离子分布不均。 （4）缓冲液的离子应该是一价的，多价离子）缓冲液的离子应该是一价的，多价离子 有较厚的双电层，移动性差。有较厚的双电层，移动性差。 （5）缓冲液的电导率

49、要低，）缓冲液的电导率要低， 避免通电时产避免通电时产 生较多的热。生较多的热。 2.ph 缓冲液缓冲液ph决定了蛋白质的带电状态，决定了蛋白质的带电状态， 电泳时应选择一个合适电泳时应选择一个合适ph，使各种蛋白质在这一，使各种蛋白质在这一 ph时净电荷差别最大以利于分离。血清蛋白醋酸时净电荷差别最大以利于分离。血清蛋白醋酸 纤维薄膜电晕常用纤维薄膜电晕常用ph8.6的巴比妥缓冲液。各种蛋的巴比妥缓冲液。各种蛋 白质均带负电荷，电泳时向正极移动。白质均带负电荷，电泳时向正极移动。 缓冲液缓冲液ph的计算的计算 ph=pka +lg(盐盐/酸酸) 电泳过程水会发生电离。电泳过程水会发生电离。

50、正极：正极：2oh h2o 1/2o22e ph 负极：负极：2h 2eh2 ph 故电泳故电泳24次后应将缓冲液正极交换，减少次后应将缓冲液正极交换，减少 这种影响。这种影响。 3.离子强度离子强度 是指溶液中各种离子的摩尔浓是指溶液中各种离子的摩尔浓 度（度（ci）与其电荷数平方（）与其电荷数平方（zi 2）乘积总和的 ）乘积总和的 1/2。即。即 i=1/2cizi 2 i的单位是的单位是mol/l。 如如0.1mol/l nacl i=0.1mol/l 0.2mol/lmgcl2 i=0.6mol/l 对于缓冲液对于缓冲液i计算，由于弱酸的电离度很低，计算，由于弱酸的电离度很低， 一般

51、只计算盐的。一般只计算盐的。 i愈大，缓冲能力越大，愈大，缓冲能力越大，ph越稳定越稳定，但缓，但缓 冲液所载分电流增加，样品所栽的电流减少，冲液所载分电流增加，样品所栽的电流减少， 电泳速度减慢，导电能力增加，产热增加。电泳速度减慢，导电能力增加，产热增加。 i过小，缓冲能力小，过小，缓冲能力小，ph不稳定不稳定，缓冲液，缓冲液 所载分电流减少，样品所载分电流增加，缓冲所载分电流减少，样品所载分电流增加，缓冲 液粘度系数降低，电泳速度加快。但样品在支液粘度系数降低，电泳速度加快。但样品在支 持物上扩散严重，分辨率降低。持物上扩散严重，分辨率降低。 兼顾两方面的影响，兼顾两方面的影响，一般在一

52、般在0.050.1 mol/l。 （二）支持介质（二）支持介质 对支持介质的基本要求是对支持介质的基本要求是 具有化学惰性，不与被分离的样品或缓冲液起具有化学惰性，不与被分离的样品或缓冲液起 化学反应，并具有一定的坚韧度。化学反应，并具有一定的坚韧度。 1.吸附吸附 使被分离样品滞留，而降低电泳使被分离样品滞留，而降低电泳 速度，造成拖尾而使分辨率降低。速度，造成拖尾而使分辨率降低。 2.电渗电渗 电泳过程中液体对固体支持物的电泳过程中液体对固体支持物的 相对移动称为电渗。相对移动称为电渗。 实际上是电泳材料表面的实际上是电泳材料表面的 电荷引起水的定向移动。电荷引起水的定向移动。 当电渗作用

53、方向与电泳方向一致，电泳速当电渗作用方向与电泳方向一致，电泳速 度加快，顺水行舟。度加快，顺水行舟。 当电渗作用方向与电泳方向相反，电泳速当电渗作用方向与电泳方向相反，电泳速 度减慢，逆水行舟。度减慢，逆水行舟。 四、常用电泳技术四、常用电泳技术 区带电泳是目前应用最广泛的一种电泳区带电泳是目前应用最广泛的一种电泳 技术，区带电泳的支持介质常用的有滤纸，技术，区带电泳的支持介质常用的有滤纸， 醋酸纤维薄膜，凝胶等。醋酸纤维薄膜，凝胶等。 （一）（一） 滤纸电泳（滤纸电泳（pe） 是应用最早的支持介质。是应用最早的支持介质。优点：优点：材料价材料价 廉易得，有一定机械强度。廉易得，有一定机械强度

54、。缺点：缺点：电泳时间电泳时间 长，长，810h，吸附作用大，造成拖尾而降低，吸附作用大，造成拖尾而降低 了分辨率，目前已淘汰。了分辨率，目前已淘汰。 （二）（二） 醋酸纤维薄膜电泳（醋酸纤维薄膜电泳（cae） 1957年年kohn首先采用，醋酸纤维素是将首先采用，醋酸纤维素是将 纤维素分子中葡萄糖单体上的羟基乙酰化而形纤维素分子中葡萄糖单体上的羟基乙酰化而形 成纤维素醋酸酯，然后用丙酮和水的混合溶剂成纤维素醋酸酯，然后用丙酮和水的混合溶剂 溶解，涂成均匀薄膜。溶解，涂成均匀薄膜。 优点：优点：对蛋白质吸附作用很小，分辨率高，对蛋白质吸附作用很小，分辨率高， 区带清晰，不吸附燃料，区带周围燃料

55、可完全区带清晰，不吸附燃料，区带周围燃料可完全 清掉，检测灵敏度较高，样品用量少清掉，检测灵敏度较高，样品用量少0.32l， 电泳时间短电泳时间短20min1小时，可透明，便于用光小时，可透明，便于用光 密度扫描仪定量。密度扫描仪定量。 缺点：缺点：有轻度电渗作用，吸水性较差，较有轻度电渗作用，吸水性较差，较 脆。脆。 （三）琼脂糖凝胶电泳（三）琼脂糖凝胶电泳（age） 琼脂糖是从琼脂中分离得到的一种多糖。琼脂糖是从琼脂中分离得到的一种多糖。 主要由半乳糖和主要由半乳糖和l-3，6-脱水半乳糖构成。常用脱水半乳糖构成。常用 浓度浓度0.51.0% 。 优点：优点：吸附作用，电渗作用很小，故分辨

56、吸附作用，电渗作用很小，故分辨 率重现性好，应用广，同工酶，脂蛋白，免疫率重现性好，应用广，同工酶，脂蛋白，免疫 电泳，样品用量少电泳，样品用量少0.63.0l，电泳时间短，电泳时间短 30min1h。透明度好，电泳后可直接扫描定量，。透明度好，电泳后可直接扫描定量， 也可烘干制成薄膜。也可烘干制成薄膜。 缺点：缺点：电泳完毕后区带易扩散，可及时固电泳完毕后区带易扩散，可及时固 定。点样方法，挖孔法，滤纸插入法。定。点样方法，挖孔法，滤纸插入法。 （四）（四） 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（page） 是一种人工合成的高分子材料，是一种人工合成的高分子材料，60年代新年代新 用于电泳

57、分析，能将血清蛋白分为用于电泳分析，能将血清蛋白分为20多种组成。多种组成。 优点：优点： 1.具有分子筛作用，分离效果好。具有分子筛作用，分离效果好。 2.化学稳定性高，是一种稳定的亲水胶体。化学稳定性高，是一种稳定的亲水胶体。 3.几乎没有吸附和电渗作用。几乎没有吸附和电渗作用。 4.机械强度好，无色透明，可直接光密度扫机械强度好，无色透明，可直接光密度扫 描。描。 5.可调节凝胶孔径以适合不同分子量的分离。可调节凝胶孔径以适合不同分子量的分离。 1. 聚合聚合 丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺丙烯酰胺甲叉丙烯酰胺 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 （acr）单体）单体 （bis）交联剂）交联剂 化学摧化化学摧化

58、 过硫酸铵过硫酸铵-temed（四甲基乙二胺）（四甲基乙二胺） 系统系统 加速剂加速剂temed促使引发剂过硫酸铵形成自由促使引发剂过硫酸铵形成自由 基，自由基与基，自由基与acr接能，使接能，使acr单体形成自由基而活单体形成自由基而活 化，从而引发聚合，聚合速度与化，从而引发聚合，聚合速度与ph，单体浓度，单体浓度， 温度有关。温度有关。 催化系统催化系统 引发剂引发剂 加速剂加速剂 光催化光催化 核黄素核黄素-temed系统，核黄系统，核黄 素经光照被还原成无色核黄素，在和痕量素经光照被还原成无色核黄素，在和痕量 氧的条件下，无色核黄素又被氧化成核黄氧的条件下，无色核黄素又被氧化成核黄

59、素自由基，使素自由基，使acr活化，从而引发聚合。活化，从而引发聚合。 优点：优点：核黄素用量少（核黄素用量少（10mg/l），对），对 样品分析无影响，聚合时间可通过调节光样品分析无影响，聚合时间可通过调节光 照时间，强度来控制。照时间，强度来控制。 2.孔径与机械强度孔径与机械强度 凝胶孔径由凝胶总浓度和交联度决定。凝胶孔径由凝胶总浓度和交联度决定。 凝胶总浓度凝胶总浓度t（g/dl）表示）表示100ml凝胶中凝胶中acr 和和bis的总克数，的总克数，t值越大，孔径越小。值越大，孔径越小。 交联度交联度c（%）表示交联剂）表示交联剂bis占凝胶占凝胶 总浓度总浓度t的百分比的百分比，c值

60、越大，孔径越小。值越大，孔径越小。 t值固定不变时，值固定不变时，c值在值在5%时，凝胶孔时，凝胶孔 径最小，大于或小于径最小，大于或小于5%，孔径都会增大，孔径都会增大。 常用标准胶常用标准胶t=7.5g/dl，孔径约，孔径约5nm。 凝胶的机械强度、弹性、透明度全要取凝胶的机械强度、弹性、透明度全要取 决于决于t及及acr与与bis的比值。的比值。 通常要求通常要求 ： t为为2%5% acr/ bis=20 5%10% acr/ bis=40 15%20 % acr/ bis=125200 3.分类分类 圆柱型圆柱型 根据凝胶的形状根据凝胶的形状 水平式水平式 平板型平板型 垂直式垂直式