HTRF技术原理和应用介绍

1、Cisbio-HTRF?技术原理与应用简介HTRF?(均相时间分辨荧光 ,Homoge neous Time-Resolved Fluoresce nee )就是一种用来检测纯液相 体系中待测物的技术。该技术基于荧光共振能量转移(FRET,Fluorescenee Resonance EnergyTran sfer)与时间分辨荧光 仃RF, Time-Resolved Fluoresce nee)两大技术，开通的一款高通量药物筛 选利器。荧光共振能量转移(FRET)利用两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为能量供体(Donor)与能量受体(Acceptor)Donor被外来光源激发(例

2、如氙灯或激光)，如果它与Acceptor比较接近，可以将能量共振转移到在 Acceptor上，使其受到激发，发岀特定波长的发射光。将Do nor与Acceptor分别与相互作用的两个生物分子结合，生物分子的结合可以将Do nor与Acceptor拉到足够近的距离，产生能量转移，由于Acceptor的发射光来自能量转移，所以实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。Donor与Atceplw距和;込无FRETDcror耳鳧坤牺更离故近，左兰FRET时间分辨荧光(TRF)TRF利用稀土元素中镧系元素的独特性质，它们与普通荧光的主要区别就是荧光的持续时间不同。普通荧光的半衰期为纳秒级

3、。镧系元素的半衰期为毫秒级，有6个数量级的差别。所以，在检测室,TRF有一个时间延迟-50us,经过这个时间延迟，普通荧光的信号几乎为零 ，所以,TRF的背景 非常低，反映样品实际情况。on阿y pulMHTRF ?的能量受体(技术创新点)HTRF的能量供体就是铕（Eu）与钛（Tb）的穴状化合物。在这个穴状化合物里，Eu与Tb被永久地嵌合在一个笼子里，结构非常稳定，这个结构由J、M、Lehn 教授发明的，并由此在1987年获得了诺 贝尔奖。HTRF 的能量受体?HTRF 的能量受体也有二种，XL665与d2、它们的光学性质相同，分子量不同，前者分子量为10KD, 实际上就就是别藻蓝蛋白 （AP

4、C）。我们将APC的亚基偶联在一起，使其不能解离，提高了稳定性， 后者分子量为1KD,在某些实验中有独特的优势。HTRF的操作步骤?HTRF操作步骤非常简单，只需要将实验所需试剂加进去，然后孵育，检测即可刺激步骤Ob一转扳检测步璽 廿II读数加人HTRF试剂铺板2- 刺激细胞3- 裂解细胞htrF?实验数据分析?HTRF采用了比值法来处理数据 ，可以去除溶液通透率、细胞大小、细胞数量不同引起的误差Traismlssion 100%屮日吨1 iwnlirWMBWEEEESI*73ai丄為怎邛比|卯1|Transmission 50%htrF应用范围受体第二信使检测受体配体结合胞内信号分子检测胞外

5、激酶活性检测胞内激酶活性检测基于抗体的夹心法与竞争法检测抗体重链含量检测抗体轻链含量测定GST含量测定CD16结合检测HIS含量测定CD32结合检测CHO宿主蛋白含量测定CD64结合检测PD1/PD-L1CTLA4/B7-1LAG3/MHC IICD47 / SIRP alphaCTLA4/B7-2Adenosin A2A蛋白-蛋白/蛋白-多肽蛋白-DNA /蛋白-RNA蛋白甲基化/蛋白乙酰化蛋白泛素化/蛋白水解univlabuniv-bio、comHTRF 技术优势：1、 操作简单，空板直接加样，加完即可检测，时间短（加样与孵育2h） !2、适合珍贵样本：整个实验体系只需 20ul3、均相检

6、测：无需包被，免洗ELISA,省时省力4、体系稳定：7天内可随时检测，信号基本不变5、数据客观真实：比值处理可有效去除背景荧光 ，假阳性率与价阴性率低6、高端检测，只需简单的酶标仪就可以轻松搞定！HTRF检测的仪器Cisbio与几乎所有的仪器供应商都建立了合作伙伴关系，下面就是经过验证的仪器列表PHERAstar FS CLARlOstarPHERAstar PlusFLUOstar OmegaPOLARatar OmegaSTECAN.Spark 10M.IniniteMIOOO &Pro IjnfoJtft F500Infnjte F200 PreSpectraMAX i3Spectra MAX ParadiqmKBiofekSvrrerav NEO2Cytation 5颈毬血3Svnerav H1Svneray 2SpectraMAX FlexStatio