基因工程的载体(四)

1、types of vectors plasmid-based virus-based chromosome-based phage-based eukaryotic virus- based (to be reviewed in gene therapy section) yac bac pac hybrid (phagemid, cosmid etc) the four major types of vectors are plasmids, bacteriophages and other viruses, cosmids(粘 粒), and artificial chromosomes.

2、 原核生物的克隆载体原核生物的克隆载体 真核生物的克隆载体真核生物的克隆载体 酵母及其他真菌的克隆载体酵母及其他真菌的克隆载体 高等植物的克隆载体高等植物的克隆载体 昆虫的克隆载体昆虫的克隆载体 哺乳动物的克隆载体哺乳动物的克隆载体 7 7 真核生物的克隆载体真核生物的克隆载体 酵母和其他真菌的载体 高等植物的克隆载体 动物的克隆载体 7.1 7.1 酵母和其他真菌的克隆载体酵母和其他真菌的克隆载体 7.1.1 2m7.1.1 2m质粒的筛选标记质粒的筛选标记 2m 2m质粒非常适合于开发成克质粒非常适合于开发成克 隆载体。它大小合适，隆载体。它大小合适，6 kb6 kb；在；在 酵母细胞内具

3、有酵母细胞内具有7070200200个拷贝。个拷贝。 它的复制依靠质粒上的复制起点，它的复制依靠质粒上的复制起点， 复制酶由宿主细胞提供，另外质复制酶由宿主细胞提供，另外质 粒本身还携带两个与复制有关的粒本身还携带两个与复制有关的 基因，基因，rep1rep1和和rep2rep2。 flpflp表示重表示重 组酶基因。组酶基因。 22质粒的两种构型质粒的两种构型 a和b是两种构型的2质粒， 图谱的环状部分代表单一顺 序，直线部分代表反向重复 序列（ir），粗线条表示复 制原点，rep1、rep2和rep3 分别代表复制酶基因和顺式 作用位点。2dna结构上最 显著的特点是存在两个反向 重复序列

4、(inverted repeat， ir)，它们被一个较大的单一 顺序区(约2.7kb)和一个较小 的单一顺序区(约2.3kb)隔开。 在酵母细胞中，由于这个反 向重复序列之间的相互重组， 使2质粒群成为两种构型(a 和b)的混合物，它们之间的 差别仅表现在两个单一顺序 区的相对方向不同。 大多数常用的酵母载体，经常使用一个普通酵母大多数常用的酵母载体，经常使用一个普通酵母 基因作为选择标记，比如一个与氨基酸的生物合成基因作为选择标记，比如一个与氨基酸的生物合成 有关的酶的基因。有关的酶的基因。leu2leu2就是一个这样的基因，它编就是一个这样的基因，它编 码的码的-异丙基苹果酸脱氢酶，在催

5、化从丙酮酸到亮异丙基苹果酸脱氢酶，在催化从丙酮酸到亮 氨酸转化过程中起作用。氨酸转化过程中起作用。 在用在用leu2leu2作筛选标记时，宿主细胞必须是一个营作筛选标记时，宿主细胞必须是一个营 养缺陷型（养缺陷型（auxotrophicauxotrophic），含有一个无功能的），含有一个无功能的leu2leu2 基因。基因。leu2 leu2 - -的酵母，不能自己合成亮氨酸，必须在的酵母，不能自己合成亮氨酸，必须在 加入亮氨酸的培养基上才能存活。这样筛选就得以顺加入亮氨酸的培养基上才能存活。这样筛选就得以顺 利进行了，因为转化体从质粒上获得了一个有功能的利进行了，因为转化体从质粒上获得了一

6、个有功能的 leu2leu2基因，它们的生长不再依赖于亮氨酸的供应。在基因，它们的生长不再依赖于亮氨酸的供应。在 实际操作中，我们把酵母细胞培养在不添加任何氨基实际操作中，我们把酵母细胞培养在不添加任何氨基 酸的基本成分培养基酸的基本成分培养基( (minimal medium) )上。只有那上。只有那 些成功转化了的细胞才能够存活形成菌落。些成功转化了的细胞才能够存活形成菌落。 selection is based on nutrition instead of drugs. yeast cells that are auxotrophic (unable to synthesize an

7、essential component, like an amino acid) can only grow when nutritionally supplemented. when the missing nutritional function is provided for by genes contained on a plasmid or extra chromosome. many eukaryotic vectors contain both eukaryotic and prokaryotic signals and can be replicated in both typ

8、es of cells. these are called shuttle vectors. yep13 基于基于2m2m质粒构建的载体，称为酵母游离型质粒（质粒构建的载体，称为酵母游离型质粒（yeast yeast episomal plasmids, yepsepisomal plasmids, yeps）。除了包含）。除了包含2m2m质粒的复制起点质粒的复制起点 和和leu2leu2基因外，基因外，yep13yep13还含有还含有pbr322pbr322质粒序列。因此，它可以在质粒序列。因此，它可以在 酵母和大肠杆菌这两种宿主细胞中进行复制和筛选。酵母和大肠杆菌这两种宿主细胞中进行复制和

9、筛选。 7.1.2 7.1.2 基于基于2m2m质粒的载体酵母游离型质粒质粒的载体酵母游离型质粒 在酵母中进行在酵母中进行 克隆试验的标准克隆试验的标准 步骤：先在大肠步骤：先在大肠 杆菌中进行，筛杆菌中进行，筛 选出重组体，纯选出重组体，纯 化重组的质粒，化重组的质粒， 检查是否符合预检查是否符合预 期的设想，再把期的设想，再把 正确的分子转进正确的分子转进 酵母细胞。酵母细胞。 7.1.3 yep7.1.3 yep可以插进酵母的染色体可以插进酵母的染色体dnadna yepyep可以和质粒一样进行复制，也可以整合到酵母染色体上。载体携带的筛可以和质粒一样进行复制，也可以整合到酵母染色体上。

10、载体携带的筛 选标记基因与酵母染色体上的突变基因，有相当高的同源性。例如，在选标记基因与酵母染色体上的突变基因，有相当高的同源性。例如，在yepyep 质粒上的质粒上的leu2leu2基因和酵母突变了的基因和酵母突变了的leu2leu2基因之间就有可能重组，最终导致基因之间就有可能重组，最终导致 整个质粒整合到酵母的染色体上。该质粒可以一直整合到染色体上，也可整个质粒整合到酵母的染色体上。该质粒可以一直整合到染色体上，也可 以再经过一次重组被切割下来。重组后以再经过一次重组被切割下来。重组后leu2leu2基因有两个拷贝，通常一个是基因有两个拷贝，通常一个是 有功能的，而另一个是沉默的。有功能

11、的，而另一个是沉默的。 7.1.3 7.1.3 其他类型的载体其他类型的载体 （1 1）酵母整合型质粒）酵母整合型质粒 （yeast integrative yeast integrative plasmids, yipsplasmids, yips）是一个把）是一个把 细菌质粒上加一个酵母基因细菌质粒上加一个酵母基因 构建的。构建的。yip5yip5就是在就是在pbr322pbr322 中加入酵母基因中加入酵母基因ura3ura3。该基。该基 因编码的酶催化嘧啶核苷酸因编码的酶催化嘧啶核苷酸 合成途径的最后一步。合成途径的最后一步。ura3ura3 可以像可以像leu2leu2一样作为筛选标

12、一样作为筛选标 记。记。yipyip不包含不包含2m2m质粒的任质粒的任 何部分，不能自主复制，但何部分，不能自主复制，但 它可以整合到酵母染色体上它可以整合到酵母染色体上 而保存下来。而保存下来。整合的过程和整合的过程和 yepyep一样。一样。 plasmid cannot replicate in yeast since it lacks a yeast origin of replication 酵母复制型质粒携带一段酵母复制型质粒携带一段 酵母染色体酵母染色体dnadna序列，其序列，其 中包含复制起点中包含复制起点( (arsars) )， 所以该质粒可以自主复制。所以该质粒可以自

13、主复制。 和复制起点接近的地方存和复制起点接近的地方存 在几个酵母基因，以其中在几个酵母基因，以其中 的两个座位可以用作筛选的两个座位可以用作筛选 标记。它是在标记。它是在pbr322pbr322质粒质粒 中加上酵母基因中加上酵母基因trp1trp1。该。该 基因与色氨酸合成有关，基因与色氨酸合成有关， 在染色体上紧挨着复制起在染色体上紧挨着复制起 点。在点。在yrp7yrp7中的这一段酵中的这一段酵 母染色体母染色体dnadna序列，同时序列，同时 包含包含trp1trp1基因和复制起点。基因和复制起点。 （2）酵母复制型质粒）酵母复制型质粒 （yeast replicative plasm

14、ids, yrps） yeast episomal plasmid (yep) a yeast vector carrying the 2 m circle origin of replication. yeast integrative plasmid (yip) a yeast vector that relies on integration into the host chromosome for replication. yeast replicative plasmid (yrp) a yeast vector that carries a chromosomal origin o

15、f replication. 在某一次特定的克隆实验中，到底选择哪一种酵母在某一次特定的克隆实验中，到底选择哪一种酵母 克隆载体，要考虑下面克隆载体，要考虑下面3 3个因素。个因素。 转化频率（转化频率（transformation frequencytransformation frequency） 在宿主细胞中的拷贝数在宿主细胞中的拷贝数 稳定性稳定性 用每微克的质粒用每微克的质粒dnadna可以获得的转化体的数目来表示。可以获得的转化体的数目来表示。 当需要大量的重组体，或被克隆的当需要大量的重组体，或被克隆的dnadna的初始量非常少的初始量非常少 时，高的转化效率非常必要。时，高的转

16、化效率非常必要。yepyep有最高的转化效率有最高的转化效率， 每微克可以产生每微克可以产生10 00010 000100 000100 000个转化的细胞。个转化的细胞。yrpyrp 也不错，每微克可以产生也不错，每微克可以产生1 0001 00010 00010 000个转化的细胞。个转化的细胞。 但每微克但每微克yipyip只能产生不到只能产生不到1000 1000 的转化体。的转化体。 转化频率（转化频率（transformation frequencytransformation frequency） yepyep和和yrpyrp有较高的拷贝数有较高的拷贝数：分别是：分别是20205

17、050和和5 5100100。 而通常情况下，而通常情况下，yipyip在每个细胞中只存在一份拷贝。当在每个细胞中只存在一份拷贝。当 我们的目的是要获得被克隆的基因所编码的蛋白质时，我们的目的是要获得被克隆的基因所编码的蛋白质时， 拷贝数显得很重要，因为基因的拷贝数越多，所获得拷贝数显得很重要，因为基因的拷贝数越多，所获得 的蛋白质也就越多。的蛋白质也就越多。 在宿主细胞中的拷贝数在宿主细胞中的拷贝数 那是因为那是因为yipyip可以产生非常稳定的重组体，要丢失整合可以产生非常稳定的重组体，要丢失整合 到染色体上的到染色体上的yipyip的可能性非常小。与之对照的是，的可能性非常小。与之对照的

18、是， yrpyrp转化体非常不稳定，在出芽生殖时转化体非常不稳定，在出芽生殖时yipyip质粒喜欢聚质粒喜欢聚 集在母代细胞中，结果使得子代细胞变回了非转化体。集在母代细胞中，结果使得子代细胞变回了非转化体。 yepyep有着类似的毛病，尽管近年来对有着类似的毛病，尽管近年来对2m2m质粒的更深一质粒的更深一 步了解使得步了解使得yepyep的稳定性有所增加。如果克隆实验要求的稳定性有所增加。如果克隆实验要求 酵母重组体细胞必须长时间保存克隆的基因，酵母重组体细胞必须长时间保存克隆的基因，yipyip是最是最 佳的选择。佳的选择。 稳定性稳定性 7.1.5 7.1.5 可以用酵母人工染色体来克

19、隆大片段可以用酵母人工染色体来克隆大片段dnadna 染色体的几个关键成分染色体的几个关键成分 （1 1）着丝粒，在细胞分裂时，需要借助它把染色）着丝粒，在细胞分裂时，需要借助它把染色 体正确地分配到子代细胞中去。体正确地分配到子代细胞中去。 （2 2）两个端粒，在染色体的末端的结构，是复制）两个端粒，在染色体的末端的结构，是复制 所必需的结束位置，还可以避免染色体被外源外切所必需的结束位置，还可以避免染色体被外源外切 核酸酶消化。核酸酶消化。 （3 3）复制起点，与质粒的复制起点功能一样，是）复制起点，与质粒的复制起点功能一样，是 染色体上染色体上dnadna复制的起始位置。复制的起始位置。

20、 一旦人们认识到了染色体的结构，就在想有没有可一旦人们认识到了染色体的结构，就在想有没有可 能用能用dnadna重组技术把各个组分分离开，再在试管里把重组技术把各个组分分离开，再在试管里把 它们连接起来，以创造一个新的染色体。因为自然界它们连接起来，以创造一个新的染色体。因为自然界 中存在的酵母染色体的长度有好几十万个碱基对，人中存在的酵母染色体的长度有好几十万个碱基对，人 们有可能用这种人工染色体来克隆大片段的染色体。们有可能用这种人工染色体来克隆大片段的染色体。 yac载体的结构和用途载体的结构和用途 已经开发的已经开发的yac(yeastyac(yeast artificial chro

21、mosome) artificial chromosome)载体有好载体有好 几种，它们都是按照相同的思路构建的，下面用几种，它们都是按照相同的思路构建的，下面用pyac3pyac3来说明。来说明。 pyac3pyac3以以pbr322pbr322为基础，插入了一些酵母基因。其中两个基因，为基础，插入了一些酵母基因。其中两个基因， ura3ura3和和trp1trp1分别作为分别作为yipyip和和yrp7yrp7的筛选标记被介绍过。在的筛选标记被介绍过。在yrp7yrp7 中的那一段酵母染色体中的那一段酵母染色体dnadna除了包含除了包含trp1trp1外还含有复制起点。外还含有复制起点。

22、 而在而在pyac3pyac3中，这段序列扩展得更长，还包含了称为中，这段序列扩展得更长，还包含了称为cen4cen4的一的一 段段dnadna，即酵母第四号染色体的着丝粒序列。因此，这个插入，即酵母第四号染色体的着丝粒序列。因此，这个插入 的片段的片段trp1-trp1-复制起点复制起点-cen4-cen4，包含了染色体，包含了染色体3 3个必需成分中的个必需成分中的 两个。两个。 第三个必需组分是端粒，由称为第三个必需组分是端粒，由称为teltel的两段序列提供。的两段序列提供。 现在还剩下现在还剩下pyac3pyac3的另外一个部分没有介绍，也就是的另外一个部分没有介绍，也就是 sup4

23、sup4（赭石突变抑制基因），该基因是筛选标记，也（赭石突变抑制基因），该基因是筛选标记，也 是克隆实验中新的是克隆实验中新的dnadna插入位点。插入位点。 用用pyac3pyac3进行克隆的策进行克隆的策 略如下。把载体用略如下。把载体用bam bam hihi 和和snasnabibi双酶切，这样就形双酶切，这样就形 成了三个片段。移去成了三个片段。移去bam bam hihi位点之间的片段，留下位点之间的片段，留下 另外两个片段，每一片段另外两个片段，每一片段 的末端分别是的末端分别是teltel序列和序列和 snasnabibi位点。要被克隆的位点。要被克隆的 dnadna，两端必须

24、切成平端，两端必须切成平端 （snasnabibi是一个平端内切酶，是一个平端内切酶， 识别识别tacgtatacgta序列）。把三序列）。把三 者结合起来，就形成了人者结合起来，就形成了人 工染色体。工染色体。 snabi: tac gta 用原生质体转化的方法把人工染色体转入酿酒酵用原生质体转化的方法把人工染色体转入酿酒酵 母。用作宿主的菌株是双营养缺陷型，母。用作宿主的菌株是双营养缺陷型，trp1trp1- -uraura- -，可，可 以被人工染色体的筛选标记基因恢复成以被人工染色体的筛选标记基因恢复成trp1trp1+ +uraura+ +。在。在 基本培养基平板上培养，可以筛选出转

25、化体。只有那基本培养基平板上培养，可以筛选出转化体。只有那 些含有结构正确的人工染色体的转化体可以生存，如些含有结构正确的人工染色体的转化体可以生存，如 果染色体构建错误，如在被克隆的果染色体构建错误，如在被克隆的dnadna片段两侧连接片段两侧连接 了相同的两段载体了相同的两段载体dnadna片段，则因缺少一种筛选标记，片段，则因缺少一种筛选标记， 使得转化体不能在基本培养基上存活。而外源使得转化体不能在基本培养基上存活。而外源dnadna是是 否插入，可由否插入，可由sup4sup4（赭石突变抑制基因）的插入失活（赭石突变抑制基因）的插入失活 判断，即可以简单地由菌落的颜色看出：白色菌落是

26、判断，即可以简单地由菌落的颜色看出：白色菌落是 重组体，而红色菌落则不是。重组体，而红色菌落则不是。 在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密在基因的编码区中，若某个密码子发生突变后变成终止密 码子，则称这样的突变为赭石突变（突变为码子，则称这样的突变为赭石突变（突变为 uaauaa），或琥），或琥 珀突变（突变为珀突变（突变为 uaguag），或乳白突变（突变为），或乳白突变（突变为 ugauga）。由）。由 于发生无义突变的结果，蛋白质合成只能进行到发生这种于发生无义突变的结果，蛋白质合成只能进行到发生这种 突变的部位就中止下来。另外一个基因突变（抑制基因突突变的部位就中止下来。

27、另外一个基因突变（抑制基因突 变）结果使细胞内产生某种分子，可使蛋白质合成重新继变）结果使细胞内产生某种分子，可使蛋白质合成重新继 续下去，因此抑制基因的突变的表型和野生型几乎一样或续下去，因此抑制基因的突变的表型和野生型几乎一样或 非常近似。非常近似。 与与 yac yac 载体配套工作的宿主酵母菌（如载体配套工作的宿主酵母菌（如ab1380ab1380）的胸腺）的胸腺 嘧啶合成基因带有一个赭石突变嘧啶合成基因带有一个赭石突变 adeade 2-1 2-1。带有这个突变。带有这个突变 的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变 抑制基

28、因抑制基因 sup4 sup4 的载体存在于细胞中时，可抑制的载体存在于细胞中时，可抑制 adeade 2-1 2-1 基因的突变效应，形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜基因的突变效应，形成正常的白色菌落。利用这一菌落颜 色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源色转变的现象，可用于筛选载体中含有外源 dna dna 片段插片段插 入的重组子。入的重组子。 yac yac 载体功能强大，但有一些弊端。这主要表现在载体功能强大，但有一些弊端。这主要表现在 3 3 个方面：个方面： 首先，在首先，在 yac yac 载体的插入片段会出现缺失载体的插入片段会出现缺失 （deletiondeletion）

29、 和和 基因重排基因重排 （rearrangementrearrangement） 的现象。的现象。 其次，容易形成嵌合体。嵌合就是在单个其次，容易形成嵌合体。嵌合就是在单个 yac yac 中的插入片段中的插入片段 由由 2 2 个或多个的独立基因组片段连接组成。个或多个的独立基因组片段连接组成。 最后，最后， yac yac 染色体与宿主细胞的染色体大小相近，染色体与宿主细胞的染色体大小相近， 由于其大小与内源的染色体的大小相近，就很难从中分离出来，由于其大小与内源的染色体的大小相近，就很难从中分离出来， 不利于进一步分析。不利于进一步分析。 但是但是 yac yac 的一个突出优点是，酵

30、母细胞比大肠杆菌对不稳定的一个突出优点是，酵母细胞比大肠杆菌对不稳定 的、重复的和极端的的、重复的和极端的 dna dna 有更强的容忍性。有更强的容忍性。 7.2 7.2 高等植物的克隆载体高等植物的克隆载体 7.2.1 7.2.1 根瘤农杆菌根瘤农杆菌自然界最小的遗传工程师自然界最小的遗传工程师 根瘤农杆菌根瘤农杆菌 (agrobacterium tumefaciens)是一种土壤是一种土壤 微生物，能够感染双子叶植微生物，能够感染双子叶植 物使之产生冠瘿瘤（物使之产生冠瘿瘤（crown gall）。当植物受到外伤时，）。当植物受到外伤时， 根瘤农杆菌通过伤口侵染植根瘤农杆菌通过伤口侵染植

31、 物，导致冠瘿瘤的发生。物，导致冠瘿瘤的发生。 根瘤农杆菌诱导植物体形成冠瘿的能力，与它细根瘤农杆菌诱导植物体形成冠瘿的能力，与它细 胞内存在的胞内存在的titi（tumourtumour inducing, inducing, 即肿瘤诱导）质即肿瘤诱导）质 粒有关。粒有关。titi质粒是一个相当大的质粒，长度超过质粒是一个相当大的质粒，长度超过200 200 kbkb，携带大量与感染有关的基因。，携带大量与感染有关的基因。titi质粒一个重要的质粒一个重要的 性质在于，感染后，质粒分子的一部分可以整合进植性质在于，感染后，质粒分子的一部分可以整合进植 物染色体物染色体dnadna中。这段称为

32、中。这段称为t-dna(transfert-dna(transfer dna dna ) )的的 片段（以菌株不同，长度在片段（以菌株不同，长度在151530 kb30 kb之间）。之间）。t-dnat-dna 能在植物细胞内稳定存在，还能作为染色体的一部分能在植物细胞内稳定存在，还能作为染色体的一部分 传递给子代细胞。传递给子代细胞。 titi质粒最引人注目的地方还在于质粒最引人注目的地方还在于t-dnat-dna上有上有8 8个左右的基因在植物细胞内表达，并引个左右的基因在植物细胞内表达，并引 起植物细胞癌变。这些基因包括指导生长素（起植物细胞癌变。这些基因包括指导生长素（auxinsau

33、xins）和细胞分裂素（）和细胞分裂素（cytokininscytokinins） 合成的基因，以及指导合成冠瘿碱合成（合成的基因，以及指导合成冠瘿碱合成（opinesopines）的基因。生长素和细胞分裂能促）的基因。生长素和细胞分裂能促 进细胞增殖（进细胞增殖（cell proliferation)cell proliferation)。冠瘿碱是农杆菌的营养物质，为根瘤农杆菌的。冠瘿碱是农杆菌的营养物质，为根瘤农杆菌的 生长提供碳源和氮源。根瘤农杆菌对植物进行了基因改造来为它自己服务。生长提供碳源和氮源。根瘤农杆菌对植物进行了基因改造来为它自己服务。 the transfer dna (a

34、bbreviated t-dna) is the transferred dna of the tumor-inducing (ti) plasmid of some species of bacteria such as agrobacterium tumefaciens and agrobacterium rhizogenes. it derives its name from the fact that the bacterium transfers this dna fragment into the host plants nuclear dna genome. the bacter

35、ial t-dna is about 20,000 base pairs long and contains genes that code for enzymes synthesizing opines and phytohormones. by transferring the t-dna into the plant genome, the bacterium essentially reprograms the plant cells to grow into a tumor and produce a unique food source for the bacteria. the

36、synthesis of the plant hormones auxin and cytokinin enables the plant cell to grow uncontrollably, thus forming the typically induced by agrobacterium infection. the opines are amino acid derivatives used by the bacterium as a source of carbon and energy. opine catabolism virulence region ori t-dna

37、the t-dna is bordered by 25- base-pair repeats on each end. transfer is initiated at the left border and terminated at the right border and requires the vir genes of the ti plasmid. 于是，人们很快意识到可以用于是，人们很快意识到可以用titi质粒把新的基因转质粒把新的基因转 运到植物细胞。所要做的仅仅是新基因插入运到植物细胞。所要做的仅仅是新基因插入t-dnat-dna，而，而 对于如何把它们整合到植物染色体上去，

38、这些复杂的工对于如何把它们整合到植物染色体上去，这些复杂的工 作，就交给农杆菌去完成。但在实际操作时却发现这是作，就交给农杆菌去完成。但在实际操作时却发现这是 相当棘手的一件事情：相当棘手的一件事情：titi质粒太大了，造成操作比较质粒太大了，造成操作比较 困难。困难。 最主要的问题是，要想在一个最主要的问题是，要想在一个200 kb200 kb的质粒中找到的质粒中找到 一个单酶切位点，简直是不可能的事。必须制定如何把一个单酶切位点，简直是不可能的事。必须制定如何把 外源外源dnadna插入到质粒中去的新策略。插入到质粒中去的新策略。 对对titi质粒进行改造质粒进行改造 必须把必须把titi

39、质粒加以改造，才能成为植物基因工程质粒加以改造，才能成为植物基因工程 载体。首先要除掉野生型载体。首先要除掉野生型titi质粒上使细胞发生癌变的质粒上使细胞发生癌变的 基因，基因，这样转化后的细胞才不至于癌变，才能发育成这样转化后的细胞才不至于癌变，才能发育成 植株植株 。这是可以办到的，因为与细胞癌变有关的基因。这是可以办到的，因为与细胞癌变有关的基因 仅仅存在于仅仅存在于t-dnat-dna的内部，且与感染不相关。感染主要的内部，且与感染不相关。感染主要 由由titi质粒的病毒性区域控制。质粒的病毒性区域控制。 事实上，事实上，t-dnat-dna内与感染有关的部分只是两段长内与感染有关的

40、部分只是两段长25 bp25 bp 的重复序列，它们处于整合区域的两端。任何在两端的重复序列，它们处于整合区域的两端。任何在两端 拥有这两个重复序列的拥有这两个重复序列的dnadna，都会被认为是，都会被认为是t-dnat-dna，会，会 被整合到植物染色体上。因此，我们可以从正常的被整合到植物染色体上。因此，我们可以从正常的t-t- dnadna中去除癌基因，然后加上一套新的基因，而不用中去除癌基因，然后加上一套新的基因，而不用 担心会影响感染过程。担心会影响感染过程。 （1 1）双元载体系统（）双元载体系统（binary vectorbinary vector） 双元载体系统由农杆菌中两个

41、自我复制的质粒双元载体系统由农杆菌中两个自我复制的质粒 构成。一种是微型质粒（构成。一种是微型质粒（mini-ti plasmidmini-ti plasmid），这），这 是一种穿梭载体，可以在大肠杆菌和农杆菌中进行是一种穿梭载体，可以在大肠杆菌和农杆菌中进行 复制，含有左右复制，含有左右t-dnat-dna边界，在两个边界，在两个t-dnat-dna边界之间边界之间 插入目的基因。另一种是辅助插入目的基因。另一种是辅助titi质粒，为质粒，为t-dnat-dna向向 植物细胞的转移提供植物细胞的转移提供virvir基因功能。基因功能。 用用titi质粒向植物细胞内引入新的基因质粒向植物细胞

42、内引入新的基因 一个典型的微型质粒包括如下组分：（一个典型的微型质粒包括如下组分：（1 1）多克隆位点；（）多克隆位点；（2 2）一个广泛寄主范围）一个广泛寄主范围 复制起点，该复制起点在大肠杆菌和农杆菌中都能发挥作用；（复制起点，该复制起点在大肠杆菌和农杆菌中都能发挥作用；（3 3）在细菌细胞）在细菌细胞 中起作用的选择标记；（中起作用的选择标记；（4 4）在植物细胞中的选择标记；（）在植物细胞中的选择标记；（5 5）t-dnat-dna的左右边界。的左右边界。 辅助辅助titi质粒含有指导质粒含有指导t-dnat-dna转移的转移的virvir基因，但是基因，但是t-dnat-dna被完全

43、删除。被完全删除。 vir genes and t-dna can be on separate plasmids only left and right borders (lb the 3 and 5 ends of the p element are recognized by transposase and are required for transposition to occur. to produce transgenic fruit flies by this method, the functionally different regions of the p element

44、 are incorporated into two different bacterial plasmids. the donor plasmid contains three necessary elements: the transgene (orange); a marker gene (green) used to indicate flies in which the plasmid dna is transposed to a recipient chromosome; and both ends of the p element (dark purple) 3 p and 5

45、p flanking the other two genes. it does not contain transposase. in this example, the marker is the dominant w+ allele, which confers red eye color. the red bracket indicates the segment of the donor plasmid that can transpose into the fly genome. the other plasmid carries the p element (encoding tr

46、ansposase) with mutations in one end, which prevent it from transposing. the two plasmids are co-injected into blastoderm embryos homozygous for the recessive w allele, which confers white eye color. transposase synthesized from the gene on the p- element plasmid catalyzes transposition of the donor

47、 plasmid dna into the fly genome. because transposition occurs only in germ-line cells (not in somatic cells), all the g0 adults that develop from injected embryos have white eyes. mating of these flies with white-eyed flies will yield some g1 red-eyed progeny carrying the transgene and the marker a

48、llele (w+) in all cells. p elements in nature are normally active only in the germline because the third intron of the p transposase mrna is spliced out in that tissue, but not in the soma 基于昆虫病毒的克隆载体基于昆虫病毒的克隆载体 尽管人们并没有开发应用于果蝇的病毒载体，但尽管人们并没有开发应用于果蝇的病毒载体，但 有一类病毒在以其他昆虫为宿主的基因克隆中发挥有一类病毒在以其他昆虫为宿主的基因克隆中发挥

49、着重要作用，那就是杆状病毒（着重要作用，那就是杆状病毒（baculovirusbaculovirus）。杆）。杆 状病毒的主要用途是产生重组蛋白质。状病毒的主要用途是产生重组蛋白质。 杆状病毒基因组是单一闭合环状双链杆状病毒基因组是单一闭合环状双链dnadna分子，大小分子，大小 为为9090160kb160kb。杆状病毒研究较多的是。杆状病毒研究较多的是苜蓿银纹夜蛾苜蓿银纹夜蛾 核多角体病毒核多角体病毒(autographa californica multiple (autographa californica multiple nuclear polyhedrosisvirus, acm

50、npvnuclear polyhedrosisvirus, acmnpv) )，其宿主是，其宿主是 草地贪夜蛾草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda, sf(spodoptera frugiperda, sf) )；家蚕核家蚕核 型多角体病毒型多角体病毒(bombyx mori nuclear polyhedrosis(bombyx mori nuclear polyhedrosis virusvirus，bmnpvbmnpv) )，其宿主是家蚕，其宿主是家蚕(bombyx mori(bombyx mori) )，用，用 来表达外源蛋白也多用这两种杆状病毒载体来表达外源蛋白也多

51、用这两种杆状病毒载体 杆状病毒的基因表达分为立早期表达、早期表达、杆状病毒的基因表达分为立早期表达、早期表达、 晚期表达、极晚期表达晚期表达、极晚期表达4 4 个阶段。其中在极晚期基个阶段。其中在极晚期基 因表达过程中有两种高效表达的蛋白：多角体蛋白因表达过程中有两种高效表达的蛋白：多角体蛋白 和和p10 p10 蛋白，两个基因的启动子均具有很强的启动蛋白，两个基因的启动子均具有很强的启动 性。多角体蛋白基因性。多角体蛋白基因polhpolh是一个表达量极高的极晚是一个表达量极高的极晚 期基因，感染后期在细胞中的累积可高达期基因，感染后期在细胞中的累积可高达30%30%50%50%， 从基因组

52、中删除从基因组中删除polhpolh基因时，其子代病毒不能形成基因时，其子代病毒不能形成 多角体，但并不影响病毒体的复制，因此，多角体，但并不影响病毒体的复制，因此，polhpolh基基 因位点是杆状病毒表达系统的理想外源基因插入位因位点是杆状病毒表达系统的理想外源基因插入位 点。点。p10p10也是一个高效表达的极晚期基因，同时又是也是一个高效表达的极晚期基因，同时又是 病毒复制非必需基因，因此病毒复制非必需基因，因此p10p10位点也常被用作外源位点也常被用作外源 基因插入位点。基因插入位点。 (1)(1)安全性高：杆状病毒的宿主仅限于无脊椎动物，安全性高：杆状病毒的宿主仅限于无脊椎动物，

53、 而对人畜和其他脊椎动物没有感染性，特异性强。而对人畜和其他脊椎动物没有感染性，特异性强。 (2)(2)表达效率高：应用杆状病毒极晚期多角体蛋白启表达效率高：应用杆状病毒极晚期多角体蛋白启 动子和动子和p10p10蛋白启动子强效表达外源蛋白，表达量蛋白启动子强效表达外源蛋白，表达量 最高可达所感染细胞总蛋白量的最高可达所感染细胞总蛋白量的50%50%。 (3)(3)表达的蛋白具有生物学活性：昆虫细胞为真核生表达的蛋白具有生物学活性：昆虫细胞为真核生 物细胞，其对蛋白质表达后修饰加工的方式与哺物细胞，其对蛋白质表达后修饰加工的方式与哺 乳动物细胞接近，能识别并正确地进行信号肽的乳动物细胞接近，能

54、识别并正确地进行信号肽的 切除及磷酸化、糖基化等反应，并且使外源蛋白切除及磷酸化、糖基化等反应，并且使外源蛋白 在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物在细胞内进行正确折叠、二硫键的搭配及寡聚物 的形成，使其在结构及功能上接近天然蛋白。的形成，使其在结构及功能上接近天然蛋白。 杆状病毒表达载体系统的优越性 (4) (4) 外源基因在插入到多角体蛋白基因座位时，必外源基因在插入到多角体蛋白基因座位时，必 然引起后者的缺失或灭活，因此，重组病毒将不能然引起后者的缺失或灭活，因此，重组病毒将不能 产生多角体，这不仅为重组病毒提供了供选标记，产生多角体，这不仅为重组病毒提供了供选标记， 而且重组病毒

55、不能像野生病毒一样在环境中存在，而且重组病毒不能像野生病毒一样在环境中存在， 更加安全。更加安全。 (5) (5) 容量大：杆状病毒基因组大约容量大：杆状病毒基因组大约130kb130kb，具有多个，具有多个 天然强启动子，也易于构建新的人工启动子，可同天然强启动子，也易于构建新的人工启动子，可同 时表达多个基因，并且可容纳大片段外源基因。时表达多个基因，并且可容纳大片段外源基因。 (6) (6) 基于基于bmnpvbmnpv所构建的重组病毒具有更狭窄的宿主所构建的重组病毒具有更狭窄的宿主 范围，除了家蚕外，基本没有其他宿主，而且家蚕范围，除了家蚕外，基本没有其他宿主，而且家蚕 没有飞行能力，

56、完全靠人类饲养，而且关于家蚕的没有飞行能力，完全靠人类饲养，而且关于家蚕的 研究已持续多年，遗传背景相对清楚，大规模饲养研究已持续多年，遗传背景相对清楚，大规模饲养 技术成熟，成本大大降低。技术成熟，成本大大降低。 杆状病毒表达载体系统的优越性 杆状病毒由于基因组相对较大杆状病毒由于基因组相对较大, , 外源基因的克隆不外源基因的克隆不 能通过酶切连接的方式直接插入，必须通过转移载能通过酶切连接的方式直接插入，必须通过转移载 体的介导。构建转移载体时，将拟插入杆状病毒位体的介导。构建转移载体时，将拟插入杆状病毒位 点的基因点的基因( (如多角体基因和如多角体基因和p10p10基因基因) )编码区的侧翼序编码区的侧翼序 列分别克隆进入同一质粒载体中，然后将外源基因列分别克隆进入同一质粒载体中，然后将外源基因 及相应的启动子克隆在两段侧翼序列之间