大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法(Jin-Lab)

1、精品文档大肠杆菌电转化感受态细胞制备及转化方法（Jin Qua n-Wen Lab at XMU）一、大肠杆菌电转化感受态细胞制备：第一天：1. 用枪头或接种环挑取单克隆菌落，接种入盛有5ml LB液体培养基的培养管中， 可以准备两管。37 C, 220rpm,培养过夜（14-16个小时）。2. 高温灭菌大的离心瓶（250-500ml）和几个50ml离心管，以备第二天离心收 集细菌用。3. 准备几瓶灭菌水（总量约1.5升），保存于冷冻室中以备第二天重悬浮细菌 细胞用。第二天：1. 取2-5ml过夜培养液，接入500ml LB （或2XTY）液体培养基中,控制起始0臥 =0,03-0,05。37

2、 C, 220rpm,振摇2-4小时，每半小时测一次 OD当OD 值达到0.4时，停止培养。2. 将菌液在冰上预冷30分钟。同时，开启离心机，预冷至 4 C。3. 随后将菌液分装到250ml或500ml预冷的离心瓶中，4 C, 4000rpm离心15 分钟。4. 弃上清液，先用少量（如20-50ml ）灭菌的冰水重悬沉淀的细胞团，然后加 水稀释至离心瓶的2/3体积，充分悬起细胞（可以用手握住瓶体上部震荡！）。4 C, 4000rpm离心 15 分钟。5. 弃上清液，加少量灭菌水，重悬菌体，再加水至所有细胞悬浮约500ml冰水 中。4 C, 4000rpm,离心15分钟。6. 弃上清，往离心管中

3、加入少量10%甘油（灭菌，预冷），重悬菌体，再加10% 甘油至终体积约为 20ml。4 C, 4000rpm,离心10min。7 .小心弃去上清（沉淀可能会很松散！），加入2ml 10%甘油（灭菌，预冷）重悬 浮细胞。8. 将悬浮菌液以200ul/管分装于1.5ml的Ep离心管中，在液氮中快速冷冻后， 于-70 C冰箱中保存。9. 检测转化效率：取100 l新鲜制备的感受态细胞，加入 0.01 ng已知浓度的 plasmid DNA电转化后，将重悬在1ml SOC培养液并复苏的细胞分别取10 l （1%）和100 l （10%）涂板，估测转化效率。8* Optimal efficie ncy

4、is ca. 1X10cfu/ (ig DNA for gen eral clo ning.* For library tran sformatio n, efficie ncy with ca. 1X10cfu/ (ig DNA isrequired.感受态细胞制备简要流程：收集细胞 冰水冲洗细胞2次10%甘油冲洗细胞1次 重悬细胞在10%甘油 分装 二、电转化连接产物、纯化质粒或质粒文库:1. 从-80 C冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻。2 将无菌的电击杯置于冰上预冷。3. 将解冻的感受态细胞按照40100ul/管转移至预冷的1.5ml的离心管中，小 心混匀，冰上放置。4. 取1-2

5、d纯化的质粒或克隆连接产物于 1.5ml的离心管中，冰上放置10min 加入的DNA体积过大时，其中的盐会造成电击时产生电火花！5. 打开电转仪Bio-Rad Gene Pulser System，调至Manual，调节参数设置为 25折,200 OHMs,电压为2.0 kV 这些参数设置可以根据经验略作调整。6. 将此混合物转移至已预冷的电击杯中，轻轻敲击电击杯使混合物均匀进入电 极杯的底部。用吸水纸吸干电击杯外壁的冰水。7. 将电击杯推入电转化仪，按一下 pulse键，听到蜂鸣声后，向电击杯中迅速 加入2X 500 l的SOC液体培养基，重悬细胞后，转移到 1.5ml的离心管中。8. 37

6、 C, 220-250rpm复苏 1 小时。9. 离心，涂板，置于37 C,过夜培养，次日查看转化结果。二、电击杯的清洗和保存：1. 用清水将用过的电击杯稍微冲一下，向电击杯中加入 75%酒精冲洗。2. 弃去酒精，再用蒸馏水冲洗23遍，然后用1ml的枪吸取超纯水反复吹打电 击杯10次以上。3. 加入无水乙醇1-2ml于电击杯中，浸泡5分钟。4. 弃去无水乙醇，将电击杯倒置于吸水纸上让乙醇充分挥发。5. 将清洗并干燥好的电击杯加上盖子，存放备用。几种可以选用的细菌培养基:200ml500ml1000mlLB1 g yeast extract2 g trypto ne (or pept one)2

7、 g NaCl2.5 g yeast extract5 g trypt one (or pept one)5 g NaCl5 g yeast extract10 g trypt one (or pept one)10 g NaCl2TY3.2 g Trypt one2 g Yeast Extract1 g NaCl用 5 NNaOH调 pH值至 7.08 g Trypto ne5 g Yeast Extract2.5 g NaCl用 5 N NaOH调 pH值至 7.016 g Trypt one10 g Yeast Extract5 g NaCl用 5 N NaOH调 pH值至 7.0SOC

8、4 g Trypto ne1 g Yeast Extract0.1 g NaCl2 ml KCl (250 mmol/L)1 ml MgCl 2 (2 mol/L)4 ml Glucose (1 mol/L)10 g Trypt one2.5 g Yeast Extract0.25 g NaCl5 ml KCl (250 mmol/L)2.5 ml MgCl 2 (2 mol/L)10 ml Glucose (1 mol/L)20 g Trypt one5 g Yeast Extract0.5 g NaCl10 ml KCl (250 mmol/L)5 ml MgCl2 (2 mol/L)20 ml Glucose (1 mol/L)Note: 1.溶液使用前，加入灭菌的MgCk2. SOC培养基除含有 20 mmol/L葡萄糖外，其他成分与 SOB培养基相同。SOB培养 基经咼压火菌后冷至 60 C或以下，加20 ml除菌的1 mol/L葡萄糖溶液（1