两大蛋白质染色主流方法大比较

1、两大蛋白质染色主流方法大比较 日期：2012-05-31来源：未知 标签：考马斯亮蓝 银染法 蛋白质染色 摘要：常用的蛋白质染色试剂分为已考马斯亮蓝为代表的有机试剂染色、银染、荧光染色 及同位素显色。其中考马斯亮蓝染色法的应用较为广泛，现将其与其他的蛋白质染色方法（主 要是银染法）作一比较，帮助大家更好地去选择合适的蛋白质染色方法。蛋白质的染色常用 的有4类：有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。其中有机试剂染色以考马斯亮蓝 染色法（Coomasie brilliant blue ， 汉恒生物-慢病毒腺病毒免费试用申请入口 汉恒生物-腺相关病毒（动物体内转染神器）免费试用申请入口 恩必美生

2、物新一轮2-5折生物试剂大促销！ 常用的蛋白质染色试剂分为已考马斯亮蓝为代表的有机试剂染色、银染、荧光染色及 同位素显色。其中考马斯亮蓝染色法的应用较为广泛，现将其与其他的蛋白质染色方法（主 要是银染法）作一比较，帮助大家更好地去选择合适的蛋白质染色方法。 蛋白质的染色常用的有 4类：有机试剂染色、银染、荧光染色及同位素显色。其中有 机试剂染色以考马斯亮蓝染色法（Coomasie brilliant blue，CBB）为代表，在蛋白质分析中 常用，但对低丰度蛋白质的显现较差；银染灵敏度虽高，却常与质谱不兼容；荧光染色以 SYPROt剂为主，蛋白质检测灵敏度高，能兼容质谱，但由于需要配备特殊的检

3、测仪器及试 剂的昂贵，未被作为常规方法使用；而同位素显色则存在安全性和操作局限性等问题。因此， 筛选简便、节约、检测灵敏度高、质谱兼容的蛋白质着色法是蛋白质组研究所需。由于考马 斯亮蓝染色法的广泛运用，近年来就考马斯亮蓝染色法在提高其灵敏性方面研究者们作了许 多改进，方法众多，评价不一。 我们在作双向 凝胶电泳时，将常用的几种考马斯亮蓝染色法及银染进行了比较，并就 其染色影响因素作出分析。 试剂 固相 pH 梯度干胶条（IPG strip pH3-10NL , IPG strip pH5-8, 17cm）、urea、CHAPS TBP DTT Bio-Lyte 3/10 Ampholyte 、

4、1AM、SDS Tris、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、甘 氨酸、CBB-G250均为BIO-RAD公司产品。硫酸铵及磷酸均购自成都科龙试剂厂。AgNO3为 Sigma 公司出品。Protein molecular weight marker #SW0431 为 MBI 公司出品。甲醛、 Na2S2O3与 Na2CO3分别为成都天华科技股份有限公司、重庆北碚化学试剂厂和天津市塘沽 鹏达化工厂产品。 仪器 IPGphor等电聚焦仪、proTEANH垂直电泳仪、Power PAC1000电泳仪、加样溶胀槽、 GS-800 Calibrated Densitometer 扫描仪、 PDQuest 凝胶图

5、像分析软件均为Bio-Rad 公司产 品。 细胞总蛋白质的提取 取4份经常规培养的急性早幼粒白血病细胞株（NB4）1X 107细胞各重悬于350卩1蛋白 质裂解缓冲液中 （8mol/L Urea ，2g/L CHAPS，2mmol/L TBP，2ml/L Carrier Ampholyte，痕 量溴酚兰），置冰浴中超声裂解，静置30分钟，15500Xg离心30分钟，取上清，进行蛋白 质定量。 单向定量电泳 取蛋白质分子量标准物，第一次按1 : 2稀释后，以后按1 : 3倍比例逐级稀释，经 4 级稀释后，取151上样液上样，B -半乳糖苷酶上样量依次分别为1卩g、 0.24卩g、 0.062卩g

6、、0.0156卩g、0.004卩g。作 12g/L SDS聚丙烯酰胺凝胶单向电泳，同时电泳4份 胶，显色以确定染色灵敏度。 双向电泳 取3001样品液沿水化盘中槽的边缘自左向右线性加入，将17cm IPG胶条胶面朝下 置于槽中，静置 45分钟后覆盖矿物油，在20 C溶胀1116小时。溶胀后的胶条置于等电 聚焦盘中，在 Protean IEF Cell 中进行等电聚焦，温度设置为20C，电压模式设置为：快 速升压，250 V, 0.5小时;500 V , 0.5小时;10000 V , 60000 Vh（伏特X小时）。取IEF后的 IPG 胶条，先后分别置于含DTT平衡液 1（6mol/L ur

7、ea , 2g/L SDS 0.05mol/L Tris pH 8.8 , 200ml/L gylcecol , 2g/L）及含碘乙酰胺平衡液 2（同平衡液1，但其中DTT换为2.5g/L 碘 乙酰胺）中轻微摇荡各10分钟。将平衡好的IPG胶条置于预先灌制的12g/L SDS-聚丙烯酰 胺凝胶上，封固，在 15C低温水循环条件下，15 mA/gel电泳15分钟，然后以25mA/gel 恒流电泳。 显色 取出SDS-聚丙烯酰胺凝胶，经超纯水清洗2次，每次1分钟，4块胶分别按4种不同 的染色方法显色。下列每步操作皆在摇床上进行。 4 种染色法成份组成及操作如下： 传 统考马斯亮蓝染色法：清洗后的凝

8、胶经固定液 （45.4%甲醇、 4.6%乙酸）固定 1 小时，随后用 染色液（45.4%甲醇、4.6%乙酸、0.1% CBBG250）着色过夜，再经洗脱液 （5%甲醇、7.5%乙酸） 过夜脱色至背景清晰。胶体考马斯亮蓝染色法（colloidal Coomassie brillia nt blue, cCBB）染色法：凝胶先经超纯水漂洗后，再用colloidal Coomassie blue G250染色液（1.6% 磷酸、 8%硫酸铵、 0.02% CBB G250、 20%乙醇）着色过夜，洗脱液为超纯水，换液34次直 至背景清晰。改良考马斯亮蓝染色法（modified Coomassie b

9、rilliant blue, mCBB染色 法6; 操作方法同胶体考马斯亮蓝染色法，只是染色液组成不同 （0.12% CBBG250、 10%硫酸 铵、10%磷酸、20%乙醇），着色1小时即可。银染（silver staining）:凝胶漂洗后先被固 定液（50%甲醇+ 5%乙酸）固定 1小时，随后分别用 50%甲醇和超纯水清洗各 10分钟，0.02 mg/L Na2S2O3致敏1分钟，超纯水清洗 2次，每次1分钟，再用预冷的 0.15% AgNO3着色20分 钟，超纯水再次清洗 2次，每次1分钟，2% Na2CO3 + 0.04%甲醛显色2030秒，当溶液 变黄以后除去，换新鲜的溶液后继续显

10、色直至显色适度后，以5%乙酸终止显色。 成像、分析、质谱鉴定 脱色后，凝胶经 GS-800 Calibrated Densitometer 扫描成像，用 PDQuest 软件进行分 析。切取蛋白质点，胰酶消化，行质谱鉴定。 结果 4 种染色法的蛋白质检测灵敏性分析 3 -半乳糖苷酶的上样量依次分别为1、0.24、0.062、0.0156和0.004卩g。经传统考 马斯亮蓝染色后的条带在 62ng 水平隐隐可见 ;而胶体考马斯亮蓝染色法的灵敏度稍高， 62ng 条带明显可见 ; 改良考马斯亮蓝染色法的效果更好些，在 15.6ng 水平可见条带的显示 ;而银 染法灵敏度最高，在 15.6ng 水平

11、可见清晰条带的显现，同时在 4ng 可见隐约条带。 4种染 色法的比较显示， 灵敏度最高的是银染法， 可达纳克级水平， 其次为改良考马斯亮蓝染色法， 10纳克级蛋白质能被检测。而胶体考马斯亮蓝染色法和经典考马斯亮蓝染色法稍差，检测 水平仅达几十纳克。 4 种染色法的双向电泳蛋白质点显示比较 来自NB4细胞的全蛋白经 pH 3-10NL的等电点梯度分离，SDS-PAGE二维垂直电泳后被 3 种考染法着色成像的显示可以看出传统考马斯亮蓝染色法的蛋白质点显现最少，胶体考马 斯亮蓝染色法的蛋白质点显现较多， 而改良考马斯亮蓝染色法的蛋白质点显现更多。 凝胶背 景以后二者为更清晰。 经PDQuest软件

12、进行分析，3幅图的蛋白质点显现数分别为 483、679、 890。NB4细胞的全蛋白经 pH 5-8 IPG分离，分别经改良考马斯亮蓝染色法与银染法着色成 像的蛋白点显示， 二者上样量一致， 蛋白点的显现数量相当， 但银染的蛋白点明显显示着色 重。这与单向电泳的效果相同。 4 种染色法的可操作性比较 在比较其蛋白质检测灵敏性的同时，对染色法的操作简便性、安全性以及蛋白质经质 谱鉴定的成功率也作了对比。比较显示， 考马斯亮蓝染方法简便， 但耗时较长，经改进后可 以做到无毒操作，质谱兼容性较高。银染步骤繁多，但耗时短 ; 操作过程中有甲醇、甲醛等 毒性物的接触， 质谱兼容性低。 即使我们选择的银染

13、法被文献报道为质谱兼容的， 但仍然表 现为低的蛋白鉴定率，不及考马斯亮蓝染。 讨论 凝胶染色方法对蛋白质分辨率的影响 提高双向凝胶电泳的分辨率是蛋白质组学研究尚待解决的课题及技术发展方向，影响 蛋白质分辨率的因素较多， 其中凝胶染色方法对蛋白质分辨率的影响不可忽视， 它影响了实 验的显像结果， 直接干预了后续的质谱鉴定。 目前， 在蛋白质组学领域中广泛应用的是考马 斯亮蓝染色法和银染法两种。 考马斯亮蓝(Coomassie brilliant blue, CBB G-250)的化学名称为二甲花青亮蓝，偏 酸性， 与蛋白质的碱性基团结合， 颜色由棕黄色转为深兰色。 考马斯亮蓝染色法可以达到微 克

14、级检测水平， 着色程度与蛋白量的线性动力学相关范围广， 适合定量分析。 该法由于较低 的成本、 使用方便及与下游的质谱鉴定技术的良好相容性， 而得到了非常广泛的使用。 然而 微克级的检测水平使它漏检了相当多的低丰度蛋白质， 日益成为蛋白质组学的瓶颈， 因此大 量提高染色灵敏度的研究及各种染色液的配方和方法应运而生，经文献报道的方法众多， 评 价不一。我们的试验选择了 3 种常用的考马斯亮蓝染色法进行比较， 测得传统考马斯亮蓝染 色法的灵敏度可达几百纳克， 胶体考马斯亮蓝染色法能检测到几十纳克蛋白， 改良考马斯亮 蓝染色法则可达几纳克蛋白水平。考马斯亮蓝染色法经过改进能获得高的蛋白质检测灵敏 度

15、，甚至可与银染媲美。 银染法是利用银离子与氨基酸共价结合，还原剂的加入使与胶内蛋白质结合的银离子 形成金属银而显色。文献报道检测限度可低于 1 ng 的蛋白质，其灵敏度比传统考马斯亮蓝 染色法高约 100 倍， 被广泛应用于蛋白质组学研究，但银染步骤复杂， 繁琐， 且着色线性动 力学的覆盖范围窄， 导致蛋白质差异显示的不准确性， 同时由于游离银离子及相关试剂的存 在，给后续分析及鉴定带来一定的实际困难。 我们的实验只采用了一种银染法， 结果显示银 染法的灵敏性高于所有考马斯亮蓝染色法， 4 ng 的蛋白质条带也能显现，但蛋白质鉴定成 功率低。 蛋白质检测灵敏度的影响因素 蛋白质着色显示的灵敏性

16、既取决于染色试剂，如上述分析，又与染色过程中涉及的有 机溶剂及离子有关。 在考马斯亮蓝染色法和银染法中都存在如甲醇、乙醇、 乙酸、甲醛等有 机溶剂的使用。 甲醇和乙醇在染色里起固定作用， 把蛋白质固定在凝胶中或阻滞它们在凝胶 中扩散。 同时也去除电泳过程中遗留的干扰染色过程的物质， 如去垢剂、 还原剂和缓冲液等 成分。乙酸的作用既是辅助固定蛋白质同时又维持染液的酸性度，以利于考马斯亮蓝与蛋白 质结合。他们的存在有利于获得背景清晰、 信噪比高的图像。 由于 3 种有机溶剂的相似作用， 我们在胶体考马斯亮蓝染色法及改良考马斯亮蓝染色法里，保留乙醇作为唯一的固定清洁 剂，用磷酸替代乙酸发挥酸化作用，

17、 结果显示两种考马斯亮蓝染色法获得的图像背景比传统 考马斯亮蓝染色法的要清晰，条带也锐利。 在胶体考马斯亮蓝染色法中，酸性的乙醇介质中加入硫酸铵，使得着色剂形成胶体染 色颗粒， 胶本身可不被显著着色， 蛋白染色灵敏度得以提高。 而在改良考马斯亮蓝染色法中， 在高酸、高离子环境下，蛋白质的葡糖胺和天冬酰胺酸质子化，更利于与染色剂发生结合。 因此 2 种染色法呈现出背景清晰、 蛋白检测多的图像， 且在改良考马斯亮蓝染色法中由于高 酸、高离子存在，灵敏度出现提高，几接近银染水平。 甲醛在银染中发挥还原剂作用，使结合在蛋白质上的银还原而显色。甲醛浓度影响银 染效果，浓度一般为 400500卩I/L。甲

18、醛浓度较高时胶颜色发黄，背景色混杂，难以发现 目的点 ; 浓度较低不仅染色时间延长，而且不易着色。银的络合剂硫代硫酸钠防止自由银离 子还原为金属银，可减少非特异染色，降低背景染色，其浓度一般为0.1 0.2mg/L 。该络 合剂用量过多，胶颜色过深 ; 少则不足以螯合掉游离的银离子，胶颜色发黑。 质谱兼容性的影响因素 考马斯亮蓝G-250在一定的pH时，这种染料-蛋白质复合物被完全解聚。适应于蛋白 质的质谱鉴定 ; 而银染使用的银离子及醛类造成肽间的相互交连，影响胶内蛋白质酶解及洗 脱，降低了蛋白质质谱分析的氨基酸序列覆盖率，考马斯亮蓝染蛋白质鉴定的成功率在 60%80%之间，远高于银染鉴定的成功率 （30%60%）;而我们的结果是，前者的质谱鉴定成 功率为 50%，后者仅为 5%。鉴于此， 我们也在不断地寻找新的方法，以提高银染鉴定的成功 率。 操作的安全性与简便性 由于有机溶剂的相似作用，我们在改进的考马斯亮蓝染色法里，抛弃有毒的甲醇及气 味难闻的乙酸， 同时在步骤上， 我们采用染色和固定一步法进行， 减少了第一步固定的时间， 仅用超纯水清洗， 缩短了整个染色及人与有毒物接触的时间。 结果显示， 两种考马斯