酶切位点保护碱基表

1、精品文档的切位点保护碱基-pcr引物设计用于限制性内切的 前切反应来源：easylabs 发布时间：2009-11-08 查看次数：12704本文给出了分子克隆中常用限制性内切酶的保护碱基序列，如acci , afliii , asci , aval , bamhi, bglll , bsshii , bsteii , bstxi , clal , eco ri , haeiii , hindiii , kpni , mlui , ncoi , ndei , nhei, noti , nsii , pa ci , pmei, psti , pvui , saci , sacii , sali

2、, scai , smai, spei , sphi , stui , xbai , xhoi , xmai,为什么要添加保护碱基？在分子克隆实验中，有时我们会在待扩增的目的基因片段两端加上特定 的酶切位点，用于后续的酶切和连接反应。由于直接暴露在末端的酶切位 点不容易直接被限制性核酸内切酶切开，因此在设计pcr引物时，人为的在酶切位点序列的5端外侧添加额外的碱基序列，即保护碱基，用来提高将来酶切时的活性。其次，在分子克隆实验中选择载体的酶切位点时，相临的两个酶切位点 往往不能同时使用，因为一个位点切割后留下的碱基过少以至于影响旁边 的酶切位点切割。该如何添加保护碱基？添加保护碱基时，最关心的

3、应该是保护碱基的数目，而不是种类。什么样的酶切位点，添加几个保护碱基，是有数据可以参考的。添加什么保护碱基，如果严格点，是根据两条引物的tm值和各引物的碱基分布及 gc含量。如果某条引物 tm值偏小，gc喉低，添加时多加 g或 c,反之亦反。为了解不同内切酶对识别位点以外最少保护碱基数目的要求，neb采用了一系列含识别序列的短双链寡核甘酸作为酶切底物进行实验。实验结果 对于确定双酶切顺序将会有帮助（比如在多接头上切割位点很接近时）， 或者当切割位点靠近 dna末端时也很有用。在本表中没有列出的酶，则通 常需在识别位点两端至少加上6个保护碱基，以确保酶切反应的进行。实验方法：用 丫- 32pat

4、p在t4多聚核甘酸激酶的作用下标记0.1a 260单位的寡核甘酸。取 1闻已标记了的寡核甘酸与20单位的内切酶，在 20 c条件下分别反应 2小时和20小时。反应缓冲液含70mm tris-hcl （ph 7.6）, 10 mm mgcl 2,5 mmdtt及适量的nacl或kcl （视酶的具体要求而定）。20%勺page（7m尿素）凝胶电泳分析，经放射自显影确定酶切百分率。本实验采用自连接的寡核甘酸作为对照。若底物有较长的回文结构，切割效率则可能因为出现发火结构而降低酶寡核甘酸序列切割率%2 hr20 hracc iggtcgacc00cggtcgaccg00ccggtcgaccgg00af

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10、10cccccggggg1050icccccggggga9090spe igaciagic1090ggaciagicc1090cggaciagiccg050仃人仃人仃人仃氏1人仃050sph iggcaigcc00caigcaigcaig025acaigcaigcaigi1050stu iaaggccii9090gaaggcciic9090aaaaggcciiii9090xba iciciagag00gciciagagc9090igciciagagca7590ciagiciagaciag7590xho iccicgagg00cccicgaggg1025ccgcicgagcgg1075xma iccccggggcccccgggggccccccggggggtccccccgggggga02550900759090注释：1 .如果要加在序列的 5端，就在酶切位点识别碱基序列（