阻抗蛋白质非特异性吸附载体微球的制备

1、第五章阻抗蛋白质非特异性吸附载体微球的制备5.1 前言高通量药物筛选已经发展到了如何从日益复杂的筛选中获取有效的活性分子，保证活性分子能满足后续的动物和临床筛选，提高筛选结果的效率和质量。建立合理的高通量筛选模型时， 必须考虑如何避免非特异性信号和背景噪声的干扰。特别是在低浓度的靶点分子 （多为蛋白质） 和较高浓度的干扰性非特异性分子共存的体系中， 降低非特异性信号的干扰就显得尤为重要。 如果无法解决非特异性的信号， 则可能降低检测的精确性，甚至出现假阳性和假阴性的结果，最终影响检测结果的质量。目前，常用信噪比（the signal-to-noise ratio， s/n）来评价检测和分析结果

2、的质量 11, 64, 67。信噪比， 顾名思义，就是特异性信号与非特异性噪声的比值。 信噪比越高， 说明检测和分析的结果就越可靠。 成功实施一项高通量药物筛选的项目， 要求使用的各种免疫分析能提供高信噪比。因此，针对特定的具体应用，合理设计和优化载体的表面性质，阻抗蛋白质的非特异性吸附，提高检测的信噪比，也是高通量药物筛选孜孜以求的目标。在目前采用的阻抗蛋白质非特异性吸附的材料中，其中peg 因其特殊的亲水性、链柔顺性和无毒等特性，被广泛用于制备阻抗蛋白质吸附材料136, 148, 149。研究认为空间位阻效应是长链peg 阻抗蛋白质非特异性蛋白吸附的重要原因 ;水化作用是短链的 peg 基

3、团阻抗蛋白质非特异性吸附的重要原因144, 145, 297。peg 阻抗蛋白质非特异性吸附的效果与 peg 链的分子量、链长度、链组成和链的接枝密度等有关 297-299。peg 阻抗蛋白质吸附材料的制备方法可以分为物理吸附或共混、化学接枝法 ,更高层次为制备响应性聚合物和图案化聚合物136,300。物理方法得到的 peg 分子链因其与基体材料之间的作用力弱而容易脱落，面临着时效性差和吸附性能差等问题。一般改性方法是在peg 分子链末端引入巯基，或者增加其它的作用力163。化学接枝法一共有表面接枝 (graft from) 和接枝到表面 (graft to)两种方法150。两种方法制备的 p

4、eg 阻抗材料能满足不同的要求。如 brooks 等人 299 通过表面引发的原子转移自由基聚合法(atom transportation radical polymerization ，atrp)制备了不同分子量的peg 衍生物，并接枝在聚苯乙烯的粒子上。作者发现接枝密度随着peg 分子量的增大而降低，而peg 悬挂端基的尺寸对聚合物刷的水力学厚度有重要影响。 通过 atrp 法制备的 peg 材料具有很好的阻抗性，随着接枝密度的增大，蛋白质吸附降低。在本文中，我们通过烯丙基聚乙二醇(apeg)与苯乙烯分散共聚制备阻抗蛋白质非特异性吸附的微球。本文的目的包括：(1)制备阻抗蛋白质非特异性吸附

5、的单分散性微球；(2)探讨所制备微球阻抗蛋白质非特异性的性能。5.1 实验部分5.1.1 试剂与仪器苯乙烯，化学纯 (98%)，购于广东汕头西陇化工厂。使用前，须将苯乙烯先用 5(wt)的 naoh 水溶液洗涤、萃取，以完全脱除阻聚剂，然后减压蒸馏，最后将净化后的苯乙烯密封保存于 4的冰箱中； 2， 2-偶氮二异丁腈 (aibn) ，分析纯 ( 99%)，购于天津科密欧化学试剂开发中心； 聚乙烯吡咯烷酮 (pvp)，分析纯，平均分子量约 30000，购于成都科龙化工试剂厂； 无水乙醇，分析纯 (99.7%)，购于广东光华化学厂。 aibn 、pvp 和无水乙醇分别用作自由基引发剂、稳定剂和分散

6、介质。烯丙基聚乙二醇 (apeg，分子量为 2400)购于华威锐科化工有限公司。牛血清蛋白 (bovine serum albumin, bsa ，第五组分 )，美国 amresco 公司产品。所需的仪器包括：senco s-212型恒速搅拌器上海申顺生物科技有限公司w201 恒温水浴锅上海申顺生物科技有限公司85-2 型恒温磁力搅拌器上海司乐仪器厂anke tdl-40b型离心机上海安亭科学仪器厂ws70-1 型红外线快速干燥器上海吴淞五金厂dzf 6050 真空干燥箱上海精宏实验设备有限公司hzs-h水浴振荡器哈尔滨市东明医疗仪器公司bs124s 型万分位电子天平德国， sartoriou

7、s 公司leitz-amr-1000 sem德国， leitz 公司粒径及 zeta电位测定仪（zetasizer?-hs） 英国，马尔文公司5.2.2 apeg 与苯乙烯分散共聚dispersion polymerization(a)ohonohonfig. 5-1 schematic diagram of the prepared apeg functional microspheres by apeg and stdispersion copolymerizationpst-apeg 微球采用间歇式分散聚合法来制备(fig. 5-1)。首先，将 60ml 乙醇、 0.2g aibn 、0

8、.4g pvp 和 14g 苯乙烯同时加入100 ml 四口玻璃圆底烧瓶，并使烧瓶浸入恒温水浴中。 在 250rpm 的恒速搅拌下， 体系中通入 n2(约 30min)，然后升温至 70，反应 5h。之后将 0.5g apeg 溶解于 15ml 乙醇 /水体系中，恒速滴加至烧瓶中，并将搅拌速度调整为300rpm。apeg 滴加控制在 2-4h 内，聚合反应总时间为12h。反应结束后，将制备的微球先用医用纱布粗过滤，再用乙醇和三重水分别对微球进行洗涤、离心、重分散2-3 次。最后把分散好的微球置于 60的干燥箱中干燥24h。5. 2.3 无稳定剂的 apeg 与苯乙烯的分散共聚将 60ml 乙醇

9、、 0.2g aibn 、0.5g apeg 和 14g 苯乙烯同时加入 100ml 四口玻璃圆底烧瓶，并使烧瓶浸入恒温水浴中。在 250rpm 的恒速搅拌下，体系中通入 n2(约 30min)，然后升温至 70，反应 12h。反应结束后，将制备的微球先用医用纱布粗过滤， 再用乙醇和三重水分别对微球进行洗涤、 离心、重分散 2-3 次。最后把分散好的微球置于 60的干燥箱中干燥 24h。5. 2.4 粒径及粒径分布测试取小量待测微球，分散在磷酸缓冲溶液中(ph 8.0，0.1m)，保持相同的浓度 (2mg/ml) ，在 nano-zs 纳米粒度与电位分析仪上测定粒径及分布情况。5.2.5 se

10、m将样品在真空干燥箱中充分干燥，喷金，采用leitz-amr-1000 的扫描电镜(sem)观察微球表观形貌。5.2.6 蛋白质吸附bsa 在微球上的吸附实验是在25的恒温水浴中进行的。首先在数只干净的塑料管中分别移入封闭处理后的微球悬浮液(微球含量为50mg )、不同量的bsa(0.363.96 g )溶液，然后用磷酸盐缓冲溶液(pbs，0.1 m，ph 7.0 )将溶液体积调整到5.0ml 。在每个试管中加入磁力转子，对样品溶液进行温和地磁力搅拌，微球在 25的环境温度中与bsa 共同孵化 8.0h。之后，对不同离心试管中的溶液进行离心分离，收集上清液，并用2ml 的缓冲溶液再对固相微球洗

11、涤、离心、分离、再分散，重复上述步骤2 次。最后收集所有的上清液，并对上清液中 bsa 的浓度用紫外吸光度法进行测定。微球对bsa 的固载量可根据bsa的质量平衡来计算。5. 3 结果与讨论5. 3.1 apeg 与苯乙烯分散共聚5.3.1.1 apeg 含量在稳定剂、引发剂浓度和乙醇/水比例相同的情况，考察了功能单体apeg含量对微球性质的影响，结果如fig. 5-2 和 fig. 5-3。 fig. 5-2 给出了制备的微球的 sem 图片， fig. 5-3 是 dls 测试微球的粒径和粒径分布。从 fig. 5-2 可以知道，调整 apeg 的加入量，所制备微球的单分散性并不太好。但从

12、图片中也可以看出，制备的微球基本上还是呈现球形，没有缺陷，表面很光滑。增大 apeg 的加入量，出现了更多的小粒子，将使微球的单分散性更差。 apeg 加入量为 0.2g 时，开始出现了小的粒子，但是其数目不太多；而随着 apeg 加入量的增加，出现了越来越多的小粒子。出现这种现象的原因可能与 apeg 自身聚合到一定分子量也能起到稳定剂的作用，干扰了pvp 的稳定剂作用有关。其次，可能 apeg 自身能形成微球，所以 apeg 加入量越大，小颗粒就越多。此外， apeg 加入量越大，对初始反应体系的极性改变就越大，导致粒径分布更宽。 类似的结果也见诸报道 301 。fig. 5-3 则说明随

13、着 apeg 加入量的增加，微球的粒径开始增加，在0.8g apeg 的加入量时达到最大，为4.85m。而粒径分布数据说明，大部分的情况下，其粒径分布测试数据都小于0.3，只有加入 apeg 的量为 0.8g 时，其粒径分布为 0.41。根据 fig. 5-2 和 fig. 5-3 综合考虑， apeg 加入量最佳为 0.4g，此时制备的微球单分散性较好。对比两种方法测定的粒径和粒径分布， 可知两种方法测定的结果出现了一定程度的偏差。 dls 测定的粒径分布明显好于 sem 测定的情况，而且 dls 测定的粒径也要大于 sem 测定的粒径。这是因为 dls 测定的是粒子在溶液中的状态，而 se

14、m 测定时粒子是干燥的状态。在溶液中，微球表面的一些分子链会呈现伸展状态，而且微球会呈现溶胀，所以测出的粒径会相对偏大一些。另外，在溶液中，粒子会出现团聚，特别是小粒子会吸附或沉积在大的粒子上，所以 dls 测定的粒径也会偏大。此外，在大粒子的作用下， dls 可能也难以测定出小的粒子。这也是 dls 测定的粒径分布比 sem 表现出的粒径分布要好一些， 同时也会出现偏离真实的粒径分布。fig. 5-2 the sem of apeg functional microspheres: the amount of apeg in polymerization is from 0.2, 0.4,

15、0.6, 0.8, 1.2 to 1.6 for apeg-1, apeg-2, apeg-3, apeg-4, apeg-5 andapeg-6, respectively.50.44noit0.3 u)bimr3t(sie0.2dzeiszi2s0.110.00.20.40.60.81.01.21.41.61.8apeg (g)fig. 5-3 the effect of added apeg amount on the average particle size and the size distribution.5.3.1.2 分级离心在上节中我们发现，采用分散聚合法制备apeg 与苯

16、乙烯共聚微球时，得到的粒子单分散性很差， 并且出现了很多颗粒很小的粒子。为了分离这些颗粒不均一的粒子，我们试图采用分级离心的方法对制备的微球进行分离。在苯乙烯聚合不同时间（ 1h、2h、3h、4h 和 6h）后，再加入 0.4g apeg 功能材料，制备了一系列的微球。对制备的微球，先在1800rpm 条件下离心 10 分钟，收集上层悬浮液；再以 3800rpm 离心 10 分钟，分别测定离心后的微球的粒径及粒径分布。fig. 5-4 就是采用分级离心后的测试结果。从 fig. 5-4 中可知，在苯乙烯聚合不同的时间后再加入apeg，用 1800rpm速度进行离心，得到的粒子粒径逐渐减少，且粒

17、径基本在3-4m之间。对于3800rpm 速度离心的粒子粒径则没有规律。两种离心速度离心的微球， 其粒径分布的数值基本在0.3 以下，这似乎表面分级离心可以提高制备微球的单分散性。然而，制备微球的 sem 照片说明并未得到单分散性很好的粒子(图片并未给出 )。其原因可能与微球容易粘附，易团聚，难以有效分离有关。fig. 5-4 the relationship of apeg added time during polymerization and the size and siza distribution of obtained microspheres,with centrifugati

18、on speeds of 1800 rpm(a) and 3800 rpm(b)， respectively.noted: apeg was added after post-polymerization in varied time.5.3.1.3 水/乙醇分散介质的极性是影响功能微球粒径及粒径分布的主要因素之一， 因为它会影响到微球初始成核的临界链长 117 。苯乙烯的分散聚合多在无水乙醇中进行，但是 apeg 不溶于无水乙醇，溶于水中，所以在分散聚合时，以水/乙醇为分散介质。我们可以采用溶解度参数（）表征分散介质的极性。对于聚苯乙烯（非31/2它可以溶解在 值相近的溶剂中。对于乙醇与水的

19、晶聚合物） ( =16.4(j/cm),)混合溶剂，其 m 可采用 5.1 式计算：(5.1)式 5.1 中，1和 分别为混合溶剂中两种成分的溶解度参数， 和 分别212为两种成分的体积分数。对于水和乙醇，其溶解度参数分别为47.43(j/cm3)1/2 和31/2，所以采用式5.1 可以计算出 6 种乙醇 /水混合溶剂的 m，其结果25.97(j/cm )见 table 5-1。table 5-1 solubility parameter ( m) in mixed solvent with different v(ethanol):v(water)v(ethanol):v(water)et

20、hanol29:114:19:113:25:14:1m (j/cm 3)1/225.9727.4427.9228.8429.7430.6131.46为了全面考察水对聚合的影响，我们先用未减压蒸馏的苯乙烯与apeg分散共聚，在不同水/乙醇比例情况下，制备得到微球的sem照片和dls测试的结果见 fig. 5-5 和 fig. 5-6。fig. 5-5 the sem of apeg functional microspheres: the volume of water in polymerization is from 5 to 30 relative to apeg-1 to apeg-6

21、respectively.note： st was only treated with 5% (w/w) naoh to remove the inhibitor.4.60.74.40.64.24.00.5 on3.8it)ubm 3.60.4 ir(tse3.4izdi0.3 es3.2zis3.00.22.80.12.629:114:19:113:25:14:1v(ethanol):v(water)fig. 5-6the effect of the water content on average particle size and size distribution. otherreac

22、tion parameters: 15ml styrene, 0.2g aibn, 0.4g pvp, and 0.4g apeg.从 table 5-1 可以看出，随着水含量的增加，乙醇/水混合溶剂的极性增强。乙醇 /水的混合溶剂的极性对微球粒径的影响见fig. 5-5 和 fig. 5-6。从 fig. 5-5的 sem 图片可知，调节水 /乙醇的比例，并未得到单分散性很好的微球, 微粒中也存在着明显的小粒子， 呈现出两极分化， 即很大的微球和很小的微球。 相对而言， apeg-2 号微球的粒径分布相对较好。从 apeg-9 微球上明显发现，很多小的微粒粘附在大的粒子上。 虽然制备的微球粒

23、径分布不太好， 但是所得微球还是呈现球形，表面也光滑，没有大的缺陷。 fig. 5-6 是采用 dls 法测定的粒径和粒径分布，从图中可以知道微球的粒径随着水体积的增加，先减少，后增大，最后再减少；而粒径分布是先增大后减少。 这一结果与他人报道有差异。 paine和 saenz 报道了在乙醇 /水的混合溶剂体系中 302, 303，苯乙烯的分散聚合制备的微球粒径随着水含量的增加而减少。出现这种现象的原因是，开始时，随着水的体积增大，分散体系的m 值增大，降低了分散介质对初始形成的聚苯乙烯的溶解性，导致成核的临界链长降低，所以成核的数目增加，粒径则会减少。然而apeg 是不溶于乙醇中的，所以随着

24、水体积的进一步增加，apeg 在水相中也会发生聚合，这必然影响到微球的粒径。其次，apeg 本身就是大分子了（分子量在2400），其聚合难度大于苯乙烯。 此外，使用的苯乙烯是没有减压蒸馏的，本身就还有残留的微量水和 naoh，这必然影响到苯乙烯的成核。总之，使用的未蒸馏的苯乙烯在试验用水的含量范围内，所制备的微球粒径分布较差。接下来，我们采用减压蒸馏过的苯乙烯与apeg 分散共聚，在不同水 /乙醇比例下制备的微球情况如fig. 5-7 和 fig. 5-8 所示。 fig. 5-7 为 sem 图片，fig. 5-8为 dls 测试情况。从 fig. 5-7 可知，相对于使用未蒸馏苯乙烯制备的

25、微球，使用减压蒸馏过的苯乙烯所制备的微球粒径分布要窄得多， 这说明水对苯乙烯分散聚合影响非常明显，特别是在成核期。仔细观察 fig. 5-7 可以得出， apeg-14 中的微球大小非常均一，没有出现小的粒子，而且没有出现残渣，背景非常光洁。另外从其放大10000倍的照片可以发现表面非常光滑，没有小粒子的粘附。apeg-15和apeg-16明显出现了小的颗粒，其背景有残渣，不干净，不过其放大10000 倍的sem照片中（未显示在文中）显示微球表面还是非常光滑的。虽然apeg-12没有出现小的颗粒， 但是从其放大 10000 倍的照片发现， 其表面粘附着小颗粒或者条块状的东西。 出现上述的现象，

26、可能与apeg 在水中聚合有关。 apeg 不溶于乙醇中而溶于水中， 所以在水中， apeg 会聚合形成聚合物链。当apeg 聚合物链的分子量增大到一定程度，它不但起着功能单体的作用， 而且起着稳定剂的作用（参见 5.3.4）。在无水的分散体系中，apeg 不易聚合，而且 apeg 自身或apeg 形成的聚合物链难以溶解，所以它可能直接沉积在苯乙烯形成的微球表面，同时对 ps 微球的成核产生影响。当水含量越来越大时， apeg 的稳定剂作用越明显。另外， apeg 也可能自身成核，所以在 apeg-14 和 apeg-15 中出现了小的颗粒。总之，在聚合开始时是无水体系，聚合一段时间后加入的a

27、peg体系中含有适量的水，这样才能抑制poly （apeg ）的稳定剂作用，且有利于apeg 和 poly（apeg）从水相中传递到有机相中， 所以所得微球粒径分布很好，而且表面光滑。fig. 5-7 the sem of apeg functional microspheres: the volume of water in polymerization is from 0, 5, 10 and15, corresponding to apeg-12 to apeg-15 respectivelynote: st was distilled under reduced pressure af

28、ter treated with 5% (w/w) naoh to removethe inhibitor.6.00.285.50.24 noi5.0t)ubmi0.20r(t4.5seizdiesz4.0i0.16s3.53.00.1229:128:226:424:630:0v(ethanol):v(water)fig. 5-8 the effect of the ratio of ethanol and h 2o in polymerization system on average particle size and size distribution of obtained micro

29、spheres. note: st was distilled under reduced pressure after treated with 5% (w/w) naoh to remove the inhibitor从 fig.5.8 的 dls 测试中可以看出，随着聚合体系中水含量的增加，微球的粒径先增大后减少，最后几乎相同；粒径分布都在 0.1 到 0.2 之间，说明分布情况较好。常规的分散聚合试验结果表明 302, 303 ，随着水含量的增加，制备的微球粒径是减少的，而粒径分布是增大。杨万泰课题组 304 观察了三种不同情况下，水与甲醇体系对微球成核与成长的影响。我们的试验结果与常

30、规分散聚合有明显的差异，其原因可能与 apeg 自身的聚合和不溶解于乙醇中。 同样，dls 与 sem测试结果存在差别。5.3.2 优化聚合条件fig. 5-9 the sem of functional microspheres. dmf/ethanol as a solvent was in preparedapeg-17; functional microspheres under one pot method for apeg-18.为了探讨 apeg 与苯乙烯分散共聚的情况， 我们用 15ml dmf 或二氯甲烷替代水，与 60ml 无水乙醇为分散介质。结果发现，以二氯甲烷和乙醇作为

31、分散介质，聚合体系出现了凝胶，没有得到微球；以 dmf 和乙醇为分散介质时，制备微球的 sem 见 fig. 5-9 中的 apeg-17。虽然 dmf 的 m 与乙醇相似，理论上应该得到单分散很好的微球，然而从 sem 分析可以发现，制备微球单分散性也很差，而且有些微球出现了残缺，不光滑。接着，我们采用一锅法分散聚合，即将 0.4g apeg 与 15ml 苯乙烯同时加入到聚合体系中，反应 12h 后，对所制备微球进行 sem 分析，结果见 apeg-18。从图中可知，虽然微球的单分散性同样较差， 但是没有出现严重两极分化的微球。此外，制备的微球还是呈现球形、没有缺陷、也比较光滑。如果将其与

32、采用苯乙烯预聚 5h 后再加入 apeg 所制备微球（ fig. 5-7 中的 apeg-14）进行比较，可以发现，让苯乙烯先聚合一段时间，在苯乙烯成核结束后再加入 apeg，可以有效提高粒子的单分散性。5.3.3 papeg 兼具稳定剂和功能单体的分散聚合由于 apeg 本身分子就较大（ mw=2400 ）且能聚合，所以在分散聚合中，其自身聚合到一定的分子量后将可能起到稳定剂的作用。在本小节中， 我们在不加入传统稳定剂pvp 的情况下考察apeg 是否具有稳定剂的作用。首先，我们在未加入apeg 的情况下直接将苯乙烯分散聚合，试验结果表明不能得到微球，所得的产物呈溶液态，说明此时的聚合为溶液

33、聚合。然后我们在不同水/乙醇比例下，将 0.4gapeg、0.2gaibn 、15ml 苯乙烯和 60ml 分散剂加入反应体系中，观察制备微球的情况。当分散体系为无水乙醇时，由于apeg 不溶于乙醇中，所以聚合前的体系一直未出现澄清的溶液， 呈现的是灰白色微弱的浑浊状态。即使在反应 12h 后体系也未呈现出牛奶状的乳白色，离心也未得到微球。如果往体系中加入pvp继续反应，则可以得到微球。这一现象说明，apeg 自身没有稳定剂的功能。常规的稳定剂如 pvp-30，其分子量为 30000，而 apeg 自身的分子量只有2400，所以apeg 不能起到稳定剂的作用。 另外，在没有水的环境中， ape

34、g 自身不能聚合，其分子量不能增大，所以也没有稳定作用。为了进一步探讨apeg 在苯乙烯分散聚合中的作用， 在水 /乙醇体积比例为1：4 时，每隔一段时间取出3ml 样品，其状态如 fig. 5-10 所示。从 fig. 5-10 可知，反应开始 2h 左右时，还只观察到轻微浑浊的溶液，继续进行反应，溶液变得更浑浊，大约在反应4h 时，才出现呈牛奶状的乳白色。在常规的分散聚合中，大约 15 分钟体系就呈现牛奶状的乳白色，这说明本试验中形成微球的时间要远远慢于常规的分散聚合。其次，该现象更进一步说明 apeg 本身不具有稳定剂的功能，必须聚合到一定的分子量时才能起到稳定剂作用。此外，该现象还说明

35、apeg 的自身聚合速率较慢。fig. 5-10 the progess of dispersion polymerization with reaction time: 0.5h，1h，2h，4h，6h，8h， 10h and 12h for -， respectively.对获得样品，采用dls 测定它们的粒径及分布情况，所得数据如fig. 5-11所示。从图中可以看出，4h 时，微球的粒径很小，但是其单分散性较差。随着反应的进行，微球的粒径逐渐增大，而其粒径分布逐渐变窄；当反应进行到8h时，其粒径增大到最大， 之后粒径逐渐减少， 而在反应 10h 时粒径分布达到最窄，然后逐渐变宽。870

36、.406n0.36oi)t5umbi(rte4sz0.32 iidsez3is20.2810.244681012time (h)fig. 5-11 the change of the size and size distribution along with the polymerization process为了优化水 /乙醇的比例，我们设计了水与乙醇比例依次为5:55、10:50、12:48、15:45 和 20:40。试验中发现，当水与乙醇比例为20:40 时，出现了凝胶现象，离心也未得到微球。其它比例时制备微球的 sem 见 fig. 5-12, dls 测试的粒径及分布见 fig.

37、5-13。从 sem 中可以看出，没有 pvp 的加入，也能到微球，而且所制备微球都是球形、光滑、没有瑕疵。不过也可以发现，制备微球的单分散性较差。这一试验结果表明， apeg 必须在含有一定水的分散体系中，通过自身的聚合达到一定的分子量时才能起到稳定剂的作用。当然， apeg 自身的聚合，其分子量大小并不均一，也会导致其单分散性变差。从 dls 测试结果发现，在我们测试的范围内，水与乙醇体积比为5:55 时，其制备的微球粒径分布最好，这一结果与fig. 5-12 相吻合。随着水含量的增加，微球的粒径逐渐减少，粒径分布逐渐变宽。在水与乙醇体积比为10:50 时，粒径最小，随后粒径逐渐增大。 粒

38、径分布随着水含量的增大而逐渐变宽的原因是多方面，首先随着水含量的增加， apeg 更容易聚合，其聚合物的分子量分布更不可控。其次，随着水体积的增大， 苯乙烯的分散聚合制备粒子的粒径分布也是逐渐变宽。此外，我们在实验中还发现，当水与乙醇的比例增大到 20:40 时，不能有效的制备微球。总之，水的含量对制备微球至关重要，当水与乙醇的体积比为 5:55 时能得到粒径分布相对较好的微球。fig. 5-12 the sem of functional microspheres when poly(apeg) was used as a stabilizer and functional monomer.

39、 the ratios of water and ethanol were 5:55, 10:50, 12:48 and 15:45 for apeg-19, apeg-20, apeg-21 and apeg-22,respectively.76)m5(eizs4320.80.70.6 notiu0.5 ibtris0.4 deizs0.30.20.15:5510:5012:4815:45v(ethanol):v(water)fig. 5-13 the effect of the ratio of ethanol and h 2o in polymerization system on av

40、erage particle size and size distribution of obtained microspheres when poly(apeg) was used as astabilizer and functional monomer.5.3.4 阻抗蛋白质的非特异性吸附为了考察apeg 功能化微球对蛋白质非特异性吸附的阻抗作用，我们对比了 pst-apeg 和 pst-gma 微球在相同条件下吸附bsa，分别测定它们吸附的量，其结果如 fig. 5-14 所示。从图中可以看出，随着bsa 浓度的增加， pst-gma 微球吸附蛋白质的量也随之增大，而后达到平衡；从图中

41、可以得出其最大的bsa吸附量可以达到4.8mg/g ms。对于 pst-apeg 微球，其吸附 bsa 的量随着 bsa浓度的增大而变化非常少，而且其最大吸附量也只有0.66mg/g ms, 远远低于pst-gma 微球的吸附量。这一试验结果表明，apeg 能有效阻抗蛋白质的非特异性吸附。 apeg 与苯乙烯分散共聚制备的微球，其外层的 apeg 分子链可以有效形成水化层，可以抑制蛋白质的吸附。而且apeg 自身聚合形成的聚合物链，能在微球表面对蛋白质产生空间位阻，也会阻抗蛋白质的吸附。 不过，可能是由于 apeg 不能完全有效的包裹苯乙烯微球，以及apeg 上带有的羟基可能通过与 bsa 分

42、子上的氨基或巯基等形成氢键，所以还是有少量的蛋白质能够吸附到载体上。)5.04.5sm4.0g/gm3.5(tn3.0upst-gmaom2.5pst-apegan2.0oitp1.5ros1.0ba0.50.00.20.40.60.81.01.21.41.61.82.02.2the concentration of bsa (mg/ml)fig. 5-14 the resistance of pst-apeg and pst-gma to bsa adsorption5.4 小结本章研究中，我们针对 spa 微球在生物医学分析和检测中因蛋白质非特异性吸附所带来的信噪比低、非特异性信号不易消除

43、的普遍问题，采用apeg 功能 pst 微球，考察其阻抗蛋白质非特异性的效果， 而且详细考察了 apeg 与苯乙烯分散共聚。从实验结果和分析中，我们可以总结出以下结论：(1) apeg 作为功能单体，可与苯乙烯分散共聚制备功能化微球。 apeg 含量为 0.4g，水 /乙醇体积比为 28:2 时可以制备单分散性较好的微球。分级离心可以分离不同尺寸的微球， 但是不易分离小颗粒的微球， 不能用于含有非常小尺寸的微球分离。 另外，采用减压蒸馏的苯乙烯有利于提高制备微球的单分散性。 通过优化反应参数， 制备了单分散性良好的 apeg 功能微球。(2) apeg 因其分子量不够而无法作为稳定剂， 但是在

44、水相中聚合达到一定的分子量时，可以作为稳定剂， 不过制备的微球单分散性较差， 有待进一步研究提高微球的单分散性。(3) apeg 功能化微球因水屏障和空间位阻效应，能有效阻抗蛋白质的非特异性吸附，同时也存在因蛋白质分子中的氨基或巯基与apeg 中的羟基形成氢键和 apeg 在微球表面的不完美包覆，仍然有少量的蛋白质吸附在微球上。参考文献1 n. malo, j.a. hanley, s. cerquozzi, j. pelletier, r. nadon, statistical practice in high-throughput screening data analysis, nature biotechnology, 24 (2006) 167-175.2 n. malo, j.a. hanley, g. carlile, j. liu, j. pelletier, d. thomas, r. nadon, experimental design and statistical methods for improved hi