饲料中沙门氏菌的监测概况及常规检测技术应用

1、饲料中沙门氏菌监 测情况及常规检测 技术的应用 常规沙门氏菌检测技术的应用 背景 1 饲料中沙门氏菌污染情况 2 3 背景 沙门氏菌的检测是各国检验机构对 多种食品的必检项目之一 公共卫生 学上具有 重要意义 的人畜共 患病之一 引起食物 中毒的重 要病原菌 在各类细 菌性的食 物中毒中 沙门氏菌 常居前列 不得 检出 饲料 卫生 标准 食品安 全国家 标准 欧 盟 ICM SF CA C 沙门 氏菌 DANIEL ELMER DANIEL ELMER SALMONSALMON, , (1850-1914)(1850-1914) 美国兽医微生物和病理学家。美国兽医微生物和病理学家。 是美国授予

2、的第一位兽医学是美国授予的第一位兽医学 博士。博士。18841884年任美国农业部年任美国农业部 畜牧局首任局长。他首次从畜牧局首任局长。他首次从 病猪中分离出猪霍乱沙门氏病猪中分离出猪霍乱沙门氏 菌。在医学微生物中通用的菌。在医学微生物中通用的 沙门氏菌一词，就是为纪念沙门氏菌一词，就是为纪念 他而以他的名字命名的。他而以他的名字命名的。 沙门氏菌 （ Salmonella） 一群形态、培养、生化反应 和抗原构造相类似的杆菌， 种类繁多。 已发现2500多种血清型，我 国目前发现的有200多种血 清型。 沙门氏菌主要生物学性状 革兰氏阴性短革兰氏阴性短 杆菌，无芽孢杆菌，无芽孢 和荚膜，有鞭

3、和荚膜，有鞭 毛（除鸡白痢毛（除鸡白痢 沙门氏菌、鸡沙门氏菌、鸡 伤寒沙门氏菌伤寒沙门氏菌 外），大多数外），大多数 具有毛。具有毛。 需氧或兼性厌氧；普通营养琼脂上需氧或兼性厌氧；普通营养琼脂上 生长良好。生长良好。 7-457-45均可生长，最适温度均可生长，最适温度3737， 最适最适pH6.8-7.8pH6.8-7.8。 抵抗力 60 20-30min即被杀 死 在水中能生存23周 在粪便中可生存12个 月 在冰中能生存3个月 沙门氏菌生物学特性 伤寒沙门氏菌伤寒沙门氏菌、鸡伤寒沙门氏菌鸡伤寒沙门氏菌及一部分及一部分鸡白痢鸡白痢 沙门氏菌沙门氏菌发酵糖不产气，大多数鸡白痢沙门氏菌不发酵

4、糖不产气，大多数鸡白痢沙门氏菌不 发酵麦芽糖。发酵麦芽糖。 O O抗原抗原 ViVi抗原抗原 H H抗原抗原 O O抗原抗原：为脂多糖，多糖部分决定其特异性，耐热：为脂多糖，多糖部分决定其特异性，耐热(100(100、 2.5h2.5h不破坏不破坏) )，其特异性不易丧失或变异。，其特异性不易丧失或变异。 H H抗原抗原：H H抗原存在于鞭毛中，蛋白质，不耐热，抗原存在于鞭毛中，蛋白质，不耐热，6060、 30-60min30-60min及酒精作用均可破坏其抗原性，能抵抗甲醛。及酒精作用均可破坏其抗原性，能抵抗甲醛。 ViVi抗原抗原：是一种：是一种N-N-乙酰乙酰-D-D-半乳糖胺糖醛酸聚合

5、物，半乳糖胺糖醛酸聚合物，6060 加热加热1h1h即破坏其凝集性和免疫原性。即破坏其凝集性和免疫原性。 DHL:无色半透明有黑色中心或几乎全为 黑色 酚红黄绿：菌落呈红色透明，同时培养基颜色变 红 HE：蓝绿色或蓝色，多数菌落中心黑色或几乎全 黑色 科马嘉显色培养基：呈紫色或紫红色 沙门氏菌在不同选择琼脂平板上的菌落特 征 沙门氏菌 伤寒和副伤 寒 急性肠胃炎败血症 内毒素 对人的危害 据调查，沙门氏菌是美国食物中毒致死的 主要原因。美国每年大约报告40000例沙门氏 菌感染病例。但实际的感染人数可能要达20倍 以上，因为许多轻型病人可能未确诊，据不完 全统计，每年大约1000人死于急性沙门

6、氏菌感 染。 沙门氏菌对动物的危害 畜禽食用含有沙门氏菌的饲料，就可引起疾病 或带菌。一般情况下畜禽肠道带菌率比较高。当动 物因患病、衰弱、营养不良、疲劳以致抵抗力降低 时，肠道中的沙门氏菌即可经肠系膜淋巴结和淋巴 组织进入血液引起全身感染，甚至死亡。 （1）急性败血症 多见于断奶前后（24月龄）仔猪，主 要由猪霍乱沙门氏菌引起。发热，拒食，耳根，胸前，腹下 等处皮肤出现紫斑，后期见下痢，呼吸困难，咳嗽跛行，经 14d死亡。病死率可达2040。 （2）亚急性和慢性 表现为：体温升高，畏寒；结膜炎， 顽固性下痢，伴以消瘦，脱水而死；部分病猪在病中后期皮 肤出现弥漫性湿疹。 （1）雏鸡感染：引起败

7、血症，可造成大批死忙 ；病 鸡表现虚弱，口渴，食欲不振，腹泻，发育迟滞等。 （2）成年鸡：最常见产蛋量降低或停止。另外可引起 卵巢炎，可在卵黄内带菌而传给幼雏。 （1）犊牛：体温升高，呼吸困难；排出血丝粪便；病 期延长时，腕和跗关节可能肿大，有时伴有支气管炎 和肺炎症状。 （2）成年牛：常有高热，昏迷，食欲废绝，呼吸困难， 体力迅速衰竭；怀孕母牛多数发生流产。 传播途径 最主要的传播途径是水、土壤和饲料 病菌随人和动 物的粪尿等排 泄物及病死畜 禽来污染土壤 和水源 因宰杀患病、 带菌的畜禽而 造成病菌的散 布，致使健康 动物的胴体和 环境受到污染 饲料和饮水的 污染，是导致 畜禽沙门氏菌 病

8、以及相互传 染的主要原因 危害程度分类 中华人民共和国卫生部人间传染的病原微生物名录 序号 病原菌名称 危害程 度分类 实验活动所 需生物安全 实验室级别 学名中文名 大量活菌操 作 1 S a l m o n e l l a choleraesuis 猪霍乱沙门菌 第三类 BSL-2 2Salmonella enterica肠沙门菌第三类BSL-2 3 Salmonella meleagridis火鸡沙门菌第三类BSL-2 4 Salmonella paratyphi A,B,C 甲、乙、丙型副伤 寒沙门菌 第三类 BSL-2 5 Salmonella typhi伤寒沙门菌 第三类 BSL-

9、2 6 Salmonella typhimurium鼠伤寒沙门菌 第三类 BSL-2 加强饲料的卫生管理，防止沙门氏菌的污染， 不仅是发展畜禽生产的需要，也是减少人类感染沙 门氏菌、预防食物中毒的一个重要环节。 意义 Torres G J等2011年 对西班牙3844个饲料 样品检测发现，沙门 氏菌的检出率为4.8% 美国对12个牛场的 295份饲料样品进行 沙门氏菌检测，检出 率为9.8% 国外沙门氏菌污染情况 传统检测方法 分子生物学方法 免疫学方法 常规沙门氏菌检测技术 国内现行标准 分子生物学方法 免疫学方法 传统检测方法 GB/T13 091- 2002 （培养 法） GB/T 47

10、89.4- 2010 （培养 法） GB/T2964 2-2012（ PCR法） SN/T 1059.7- 2010（实 时荧光 PCR法） GB/T 22429- 2008 （酶联免 疫法） DB34/T81 6-2008（ 免疫色谱 反应法） 传统检测方法 前 增 菌 选择 性增 菌 分离 培养 生化 鉴定 血清 学鉴 定 传统检测 方法原理 沙门氏菌 生化特性 修复 受损 伤的 沙门 氏菌 饲料 中含 大量 杂菌 主要培养基、 试剂、血清 缓冲蛋白胨水 （BPW） 氯化镁-孔雀绿 增菌液（RV） 亚硒酸盐胱氨 酸增菌液（SC） 酚红黄绿琼脂 DHL琼脂 营养琼脂 色氨酸肉汤 赖氨酸脱羧酶

11、 肉汤 尿素酶 氰化钾培养基 甘露醇 山梨醇 -半乳糖苷 沙门氏菌 O，Vi，H 型血清 主要仪器设 备与材料 高压灭菌锅 干热灭菌箱 培养箱 水浴锅 接种环 培养瓶或三角瓶 量筒 平皿 25g样 品 225ml BPW 36 16- 20h 1ml BPW增菌 液+10ml SC MM增菌液在42 、 SC增菌液在36 各培养24h 0.1ml BPW增 菌液+10ml MM 分别从MMMM和SCSC增菌 液中取1环，接种到 酚红黄绿和 DHL琼脂上培养 在36培养20-24h DHL琼脂在 36培养24h 分别选择性培养基 上挑选可以菌落进 行TSI等生化鉴定 TSI生化试验 底层产 H2

12、S 底层产酸 斜面产碱 斜面底层 产酸 产碱 底层产酸 斜面产碱 底层产 H2S 产酸产气 产酸产气产H2S 只在TSI产碱 的情况下可判 定无沙门氏菌 ，其余任何情 况均需进行生 化鉴定 生化鉴定 O.5个麦氏浊个麦氏浊 度的菌悬液度的菌悬液 依次在每个安依次在每个安 瓿瓶中滴加菌瓿瓶中滴加菌 悬液悬液23滴。滴。 第一步第一步 第二步第二步 第三步第三步 生化鉴定试剂套 装 色氨酸肉汤经 36，18 24h培养后滴 加靛基质试剂 ，片刻观察结 果，阳性为玫 瑰红色 色氨酸脱羧酶及对 照和氰化钾及对照 转种结束后需滴加 液体石蜡覆盖试验 管方可进行培养 靛基质试 验+时补 做甘露醇 山梨醇试

13、 验，试验 阳性后进 行血清学 鉴定 TSI-时，进行 ONPG试验 ， ONPG阴性 时进行血清学 鉴定 H2S+、靛基质- 、尿素-、KCN-、赖氨酸+后进行血清学鉴定 结果判定 其他商品化生化鉴定系统其他商品化生化鉴定系统 VITEK GNI+ 应用一系列小的多孔的聚苯乙烯卡片进行测 试，卡片含有干燥的抗菌药物和生化基质。先制 备一定浓度的欲鉴定菌株的菌悬液，然后将菌悬 液接种到各种细菌的小卡上，将其放入具有读数 功能的孵箱内，每隔一定时间，仪器会自动检测 培养基的发酵情况，并换算成能被计算机所接受 的生物编码。最后由计算机判定，打印出鉴定结 果。 VITEK 6-8h 商品化生化鉴定系

14、统 API 20E API 20E 生化鉴定是根据快速酶促反应及代谢 产物的检测技术发展而来的一种细菌编码鉴定法， 广泛应用于临床、食品中革兰氏阴性杆菌的快速 鉴定。 API 20E 18-24h API 20E 第第1位数位数第第2位数位数第第3位数位数第第4位数位数第第5位数位数第第6位数位数第第7位数位数结结 果果 判判 定定 O N P G A D H L D C O D C C IT H 2 S U R E T D A I N D V P G E L G L U M A N I N O S O R R G A S A C M E L A M Y A R A O X 1 2 41 2

15、41 2 41 2 41 2 41 2 41 2 4 反应反应 结果结果 - + + + +- - - - + + + - +- + -沙沙 门门 氏氏 菌菌 应得应得 数值数值 0 2 41 2 40 0 0 0 0 41 2 41 0 40 2 0 组合组合 编码编码 6 7 0 4 7 5 2 BD PhoenixTM 100 2-8h 血清学鉴定 阴性 阳性 GB/T29642-2012 饲料中沙门氏菌的快速检测方 法-聚合酶链式反应（PCR）法 SN/T 1059.7-2010 进出口食品中沙门氏菌检测方 法-实时荧光PCR法 现行标准 PCR技术原理 PCR技 术是是通 过模拟体

16、内DNA 复制的方 式，在体 外选择性 地将 DNA目 的片段进 行短时间 内大量扩 增的技术。 25g样 品 225ml BPW 36 16- 20h 1ml BPW增菌 液+10ml SC RVS增菌液在41.5、 SC增菌液在36 各培养243h 0.1ml +10ml 大豆蛋白 胨肉汤（ RVS） 煮沸 离心 PC R扩 增 电 泳 检 测 GB/T29642-2012 - 主要仪器设备、培养基、试剂 PCR仪 离心机 微量移液器 电泳仪 凝胶成像仪 分析天平 缓冲蛋白胨 水 大豆蛋白胨 肉汤 亚硒酸盐胱 氨酸增菌液 引物 Premix Taq DNA 聚合酶 琼脂糖 Marker 2

17、000 TAE缓冲液 溴化乙锭 （EB） - GB/T29642 -2012 DNA模板制备方法 方法一：热裂解法 取选择性增菌液1ml于离心管 中，12000r/min离心10min，灭 菌去离子水洗涤2次，最后用 0.2ml灭菌去离子水悬浮，煮沸 10min，将离心管迅速转移至冰 浴中冷却，10000r/min离心5min， 取上清液作为模板。 方法二：试剂盒 可选用商业试剂盒。 - GB/T29642 -2012 PCR扩增 反应体系 反 应程序 - GB/T29642 -2012 PCR结果分析及判定 结果判定：在阴性对照无条带，阳性对照有条带的前提下， 如果待测样品再330处未出现相

18、应大小的扩增条带，则可报 告未检出沙门； 如果待测样品在330bp处出现扩增条带，则为疑似阳性样品， 需用GB/T 13091进行确证，最终结果以后者为准。 - GB/T29642 -2012 实时荧光PCR原理 实时荧光PCR 是指在PCR反 应体系中加入 荧光基团，利 用荧光信号积 累实时监测整 个PCR进程， 最后通过阳性 对照、Ct值及 扩增曲线对模 板进行定性分 析的方法。 25g样 品 225ml BPW 36 16- 20h 1ml BPW增菌 液+10ml SC RVS增菌液在41.5、 SC增菌液在36 各培养243h 0.1ml +10ml 大豆蛋白 胨肉汤（ RVS） 煮

19、沸 离心 反 应 体 系 扩 增 曲 线 实时荧光PCR法 主要仪器设备、培养基、试剂 荧光定量 PCR仪 离心机 微量移液器 恒温水浴锅 高压灭菌锅 缓冲蛋白胨 水 亚硒酸盐胱 氨酸增菌液 四硫磺酸钠 孔雀绿增菌 液 引物 探针 DNA提取试 剂盒 Taq DNA聚 合酶 -SN/T 1059.7- 2010 模板DNA的制备 方法一：热裂解法 取增菌液1ml，置于离心管中， 5000r/min离心5min，灭菌生理 盐水洗涤2次，最后用1ml灭菌去 离子水悬浮，煮沸15min， 10000r/min离心5min，取上清液 作为模板。 方法二：试剂盒法 参照美国Promega公司生产的 DN

20、A抽提试剂盒，或其他等效产 品操作程序进行。 -SN/T 1059.7- 2010 实时荧光PCR扩增 反应体系（25ul） 反应条件 10PCR缓冲液2.5ul dNTPs1ul 上游引物1ul 下游引物1ul 探针1ul 模板2ul Taq DNA 酶0.5ul 双蒸水16ul 1个循环9510min 40个循环 9515s 6530s -SN/T 1059.7- 2010 样品Ct值35时，报告沙门氏菌筛选 阳性； 样品Ct值介于35-40之间，重复一次 ，如果Ct值40，且曲线有明显的对 数增长期，报告沙门氏菌筛选阳性， 否则，报告未检出； 样品Ct值40时，报告未检出。 筛选阳性的样

21、品按SN0170的规定进行 确证，以确证结果为准。 结果分析及判定 -SN/T 1059.7- 2010 其他分子生物学技术 环介 导等 温扩 增技 术 （ LAMP） 多重 PCR 技术 基因 芯片 技术 免疫学 方法 现行标准 GB/T 22429-2008食品中沙门氏菌、肠出血性大肠埃希 氏菌O157及单核细胞增生李斯特氏菌的快速筛选检验 （酶联免疫法） DB 34/T 816-2008饲料中沙门氏菌的测定 （免疫色谱反应法） 技术原理 免疫学检 测是基于免 疫学理论基 础，根据抗 原抗体的特 异性反应而 进行检测的 技术。 沙门氏菌 特异性抗体 是快速定性 检测的基础。 主要仪器设备、培