动物急性毒性实验报告

1、 生物工程综合实验 动物急性毒性实验 实验报告集 班级生工1411 学号 姓名 苏州科技大学 化学生物与材料工程学院 2017 年 实验室学生守则 一、严格遵守实验室各项规章制度和管理措施，服从教师及实验技术人员 的指导。 二、严格按照实验要求，做好实验预习 ,实验之前 5 分钟进入实验室，及时、 准确地完成实验任务，实事求是地完成实验报告，杜绝弄虚作假。 三、严格执行操作规定，爱护仪器设备及工具。凡不按教师的指导擅自操 作引起仪器、设备损坏者，应予赔偿。 四、爱护实验室公共财物，节约水电、材料和试剂。未经允许不得随便挪 动非实验需用的其他仪器，不得随便拆装仪器或将仪器、工具带至室 外。 五、

2、持实验室的严肃安静，不得大声喧哗、嘻闹，严禁在实验室内抽烟和 吃东西。 六、严防事故，确保实验室安全，发现异常情况，应及时向有关教师和管 理人员报告。 七、每次实验结束后，主动整理好仪器设备，归还所借器材，关闭电源、 水源，按指导老师的要求做好实验结束工作及室内外的清洁卫生工作， 经指导老师许可后，方可离开。 预习报告 名称 动物急性毒性实验 日期 2017.11.27-2017-12.1 实验目的和要求：使学生了解毒理学研究中动物实验的常规操作方法和技术；了解和掌握为了测定一 种未知的环境化学物对有机体是否是安全的，必须进行哪些试验，获得哪些必要的数据；这些试验的 基本步骤是什么，试验数据应

3、该如何处理。了解和掌握实验动物的选择、抓取、常规染毒和生物材料 的采集方法等内容、学习和掌握急性毒性试验和生物指标试验的目的，原理，以及测定相关的参数， 如半数致死剂量，生长抑制效应等所需要的方法和步骤。 实验材料：活环毛蚓 主要仪器：人工气候箱，分光光度计，冷冻离心机，试管13支，移液器，振荡水浴锅，烧杯，研钵等 主要步骤： 1. 清肠：挑选一定数量具有生殖环带的健康蚯蚓，用蒸馏水清洗，放于烧杯中，用保鲜膜封口，解剖 针扎孔。将烧杯置于温度为202 C,湿度约75%勺人工气候箱中清肠24h。 2溶液配制：在直径18cm的培养皿(或以1000mL烧杯代替)底铺衬滤纸，以刚好遮住皿底为宜。按预

4、备实验确定的剂量，配制系列浓度，取适量倒入培养皿中，以刚好浸没滤纸为宜 3. 滤纸实验 (1) .将清肠后的蚯蚓用去离子水冲洗干净，滤纸吸干体表水分 (2) .每组10条蚯蚓分别称重，测量体长，供试 (3) .每一培养皿放入10条蚯蚓 (4) .保鲜膜封口，解剖针扎孔。 4. 培养与观察 将培养皿置于人工气候箱中培养，设置标准实验条件：温度为 20 2C，湿度为75 7%;光照为1333 lx (间歇光照，即12h光照，12h黑暗)。计算Cd2+暴露后蚯蚓18h的LC50 24h的LC5Q 5. 低浓度Cd2+急性毒性试验 (1) . 在确定蚯蚓的24h LC50后，进行蚯蚓急性毒性实验。设置

5、空白对照组，空白对照组用去离子水 代替受试物；染毒实验前重复上述(1)步骤的清肠。 (2) .在蚯蚓的致死范围内设置 4个浓度梯度(0、1/5LC5。、1/3 LC5。、1/2 LC 50)进行蚯蚓急性毒性试 验。每组8条。 (3) .实验24h后取各浓度处理组蚯蚓3条做平行试验，洗净剪取其环带前部分，用磷酸缓冲液洗掉 表面血液，用滤纸吸干水分，放入研钵加 2 mL磷酸缓冲液进行研磨，再进行离心(9，000 r min-1) 10 min，上清液即为粗酶液。 (4) .采用改进邻苯三酚自氧化法测定 SOD舌性。 邻苯三酚自氧化速率的测定：取 4.5mL0.1mol L -1Tris-HCl (

6、pH =8.2 )缓冲液，4.2 mL蒸馏水， 混匀后在25E水浴保温20 min,取出后立即加入25C预热过的3 mmolL邻苯三酚0.3 mL以10 mmol-L -1 HCl配制，空白管用10 mmol - L -1HCI代替邻苯三酚的HCI溶液)，在25C恒温水浴锅中水浴，迅 速摇匀倒入比色皿(光径1 cm)，每隔30 s在325 nm处测定吸光度A值1次，共测3min。计算线性 范围内每分钟A的增值，此即为邻苯三酚的自氧化速率。 样品中SOD酶活力测定：加入邻苯三酚前，先加入一定体积的SOD粗酶液(约0.2 mL,需稀释)， 蒸馏水减少相应体积(即粗酶液和蒸馏水总体积为4.2 mL)

7、，其它均与上述中所述一致，计算加粗 酶液后邻苯三酚自氧化速率。需稀释至 3min内数值均有变化；数值大于1。 每毫升反应液中，每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%勺酶量定义为一个酶单位。酶活性单位的 计算公式如下： 郭恙三酣自氧优谀率- OD3?5/miH“ SOD酶活性 解三酚自葷化速率100気 50% 教师签名： 实验报告 动物急性毒性实验 一、实验目的 ： 使学生了解毒理学研究中动物实验的常规操作方法和技术； 了解和掌握为了测定一种未知的环境化 学物对有机体是否是安全的，必须进行哪些试验，获得哪些必要的数据；这些试验的基本步骤是什么， 试验数据应该如何处理。 二、实验原理 滤纸接触法毒性

8、实验简单易行，实验时间短，实验成本较低，可对受试物毒性进行初筛。 将蚯蚓与湿润的滤纸上的受试物接触，可测定土壤中受试物对蚯蚓的潜在影响。 动 物 机体 中有 一套 有效 的 抗氧 化防 御系 统( Antioxidant defense )，包 括过 氧化 物歧 化 酶 (Superoxide dismutase, SOD )、谷胱甘肽过氧化物酶 (Glutathione peroxidase, GPx )、过氧化氢 酶(Catalase, CAT )等，它们可分解进入生物体有伤害作用的异源氧化物。由于能反映多种污染物的 毒性，而且其变化可定量检测，因此抗氧化酶常被用作指示环境污染的早期预警，

9、是分子生态毒理学生 物标志物的研究热点之一。 三、实验材料与方法 1、实验材料与试剂： 活环毛蚓 氯化镉， Tris-HCl 溶液，邻苯三酚，磷酸缓冲液 2、实验仪器： 人工气候箱，分光光度计，冷冻离心机，试管 13 支，移液器，振荡水浴锅，烧杯，研钵。 3、实验方法： 1. 清肠 将直径11cm的滤纸铺于1000mL烧杯杯底(或培养皿)，加少量水，以刚浸没滤纸为宜。挑选一定 数量具有生殖环带的健康蚯蚓，用蒸馏水清洗，放于烧杯中，用保鲜膜封口，解剖针扎孔。将烧杯置于 温度为202 C,湿度约75%勺人工气候箱中清肠24h。 2. 溶液配制 在直径18cm的培养皿(或以1000mL烧杯代替)底铺

10、衬滤纸，以刚好遮住皿底为宜。按预备实验确定 的剂量，配制系列浓度，取适量倒入培养皿中，以刚好浸没滤纸为宜。 3. 滤纸实验 (1) . 将清肠后的蚯蚓用去离子水冲洗干净，滤纸吸干体表水分。 (2) . 每组 10 条蚯蚓分别称重，测量体长，供试。 (3) . 每一培养皿放入 10 条蚯蚓。 (4) . 保鲜膜封口，解剖针扎孔。 4. 培养与观察 (1) .将培养皿置于人工气候箱中培养，设置标准实验条件：温度为 20 2C,湿度为75 7%;光 照为 1333 lx (间歇光照，即 12h 光照， 12h 黑暗)。 (2) . 在20 2C环境培养。 (3) . 18h、24h 各计数 1 次，

11、记录死亡数，同时还有蚯蚓的病理症状和行为。蚓体对针刺无反应 判为死亡。 24h 后每组活蚯蚓分别称重，测量体长。24h 后结束实验。 (4) .计算Cd2+暴露后蚯蚓18h的LC50 24h的LC5Q 5低浓度Cd2+急性毒性试验 (1) .在确定蚯蚓的 24h LC50 后，进行蚯蚓急性毒性实验。设置空白对照组，空白对照组用去离 子水代替受试物；染毒实验前重复上述( 1)步骤的清肠。 (2) .在蚯蚓的致死范围内设置 4个浓度梯度(0、1/5LC50、1/3 LC50、1/2 LC50 )进行蚯蚓急性 毒性试验。每组 8 条。 (3) . 实验 24h 后取各浓度处理组蚯蚓 3 条做平行试验

12、，洗净剪取其环带前部分，用磷酸缓冲液 洗掉表面血液， 用滤纸吸干水分， 放入研钵加 2 mL 磷酸缓冲液进行研磨， 再进行离心(9， 000 r ?min-1 ) 10 min，上清液即为粗酶液。 (4) .采用改进邻苯三酚自氧化法测定 SOD舌性。 邻苯三酚自氧化速率的测定：取 4.5mL0.1mol?L-1Tris-HCI (pH =8.2 )缓冲液，4.2 mL蒸馏 水，混匀后在25E水浴保温20 min，取出后立即加入25C预热过的3 mmolL-1邻苯三酚0.3 mL (以 10 mmo?L -1 HCl配制，空白管用10 mmol?L -1HCl代替邻苯三酚的HCI溶液)，在25C

13、恒温水浴锅 中水浴，迅速摇匀倒入比色皿(光径 1 cm),每隔30 s在325 nm处测定吸光度A值1次，共测3min。 计算线性范围内每分钟 A 的增值，此即为邻苯三酚的自氧化速率。 样品中SOD酶活力测定：加入邻苯三酚前，先加入一定体积的SOD粗酶液(约0.2 mL,需稀 释)，蒸馏水减少相应体积(即粗酶液和蒸馏水总体积为4.2 mQ,其它均与上述中所述一致，计算加 粗酶液后邻苯三酚自氧化速率。需稀释至3min内数值均有变化；数值大于1。 四、实验结果与分析： 1、受试物的基本物化性质；实验动物的饲养条件(包括温度、湿度、光照条件等) 氯化镉：外观与性状：无色单斜晶体熔点C） : 568相

14、对密度（水=1）: 4.05 沸点（C ） : 960溶解性：易溶于水，溶于甲醇、乙醇。水溶液中的镉离子可被硫离子沉淀。 蚯蚓的饲养条件：温度18-22 C,光照，保证湿度 2、染毒处理前后蚯蚓外观生长发育变化表（体重、体长、行为等）。 表1 Cd2+染毒处理前蚯蚓外观生长发育变化表 Cd+处理浓度（mg L-1） 项目 O（CK）12345 数量（条） 11 11 11 11 13 12 总体重（g） 6.10 6.21 5.93 5.82 6.16 5.77 平均体重（g） 0.55 0.56 0.54 0.53 0.47 0.48 平均体长 6.74 7.12 6.95 6.68 7.3

15、 6.22 (cm) 行为 正常蠕动 正常蠕动 正常蠕动 正常蠕动 正常蠕动 正常蠕动 表2 Cd2+染毒处理24h后蚯蚓外观生长发育变化表 项目 Cd+处理浓度（mg L-1） 0(CK) 1 2 3 4 5 数量（条） 11 11 11 10 4 0 总体重（g） 5.72 6.21 4.47 4.11 1.16 0 平均体重（g） 0.51 0.56 0.41 0.41 0.29 0 平均体长 （cm） 6.43 6.65 6.29 5.36 4.5 0 行为 正常蠕动 蠕动减弱 蠕动减弱 蠕动减弱 蠕动减弱 无 分析：由表1, 2可见除了全部死亡的蚯蚓之外，在体重和体长方面，其余各组的

16、蚯蚓总体重和平均体 重均减小，平均体长均减小，浓度最高的一组减小的幅度最大。在蚯蚓的行为活动方面，染毒前蚯蚓活 力旺盛，正常蠕动，Cd2+处理24小时之后，除对照组里的蚯蚓正常蠕动之外，其余各组的蚯蚓的行为 活动均受到不同程度的影响，蠕动速度随着 Cd2啲浓度升高而逐渐减弱 解剖后蚯蚓的形态观察： 1组为对照组，可清晰地观察到蚯蚓的体腔清晰透明，血管呈鲜红色，肠道为 正常的棕灰色，生殖腺呈白色球状，对称分布与两侧，结构完整。2组染毒浓度较低，与1组差距不大, 3、致死时各组蚯蚓个体的形态和解剖观察：观察结果主要部位（环状带） O 但血管颜色略微变深，肠道略微发黑。从 3组开始，随着染毒浓度的升

17、高，体色逐渐变浅，体腔逐渐浑 浊，血管颜色变深发黑，肠道颜色发黑，和体腔粘合在一块，生殖腺破碎化脓，颜色略微发黄，不再是 纯白色的球状。 染毒18小时蚯蚓形态观察：1组为对照组，2-6组浓度梯度逐渐增加，由上图观察得，除对照组体表正 常，蠕动正常之外，2-4组未死的蚯蚓出现部分症状，蠕动能力明显减弱，身体变软萎缩，体色变浅， 环带肿大充血呈黄色，有黄色体液渗出。5组和6组两个浓度梯度蚯蚓有断裂现象，有的断成多节，呈 串珠状；滤纸上有血迹。 染毒24小时蚯蚓形态观察：1组为对照组，由于18小时第6组全部死亡，所以2-5组浓度梯度逐渐增 加，对照组体表正常，但由于缺乏养分，蠕动速度减慢，成团聚集在

18、一起，2-3组正常存活，但上述症 状更加明显，且成团聚集，4-5组出现死亡，死亡的蚯蚓症状如上所述，而存活的蚯蚓体色明显变浅， 几乎不蠕动，同样成团聚集。 4、记录不同受试物浓度对应的死亡情况，以剂量对数为横坐标，死亡百分率为纵坐标作 图并求得半数致死浓度LC5o。 表3 Cd2+染毒处理18h后蚯蚓的死亡情况统计表 项目 CcT处理浓度（mg L-1） O(CK) 1 2 3 4 5 数量（条） 11 11 11 11 13 12 死亡数（条） 0 0 0 0 7 12 死亡率（% 0 0 0 0 53.8% 100% 平均死亡数（条） 0.275 平均死亡率（% 25.6% 计算出 18h

19、 的 LG=1557.908 表4 Cd2+染毒处理24h后蚯蚓的死亡情况统计表 项目 Cd+处理浓度（mg L-1） 0(CK) 1 2 3 4 5 数量（条） 11 11 11 11 13 12 死亡数（条） 0 0 0 1 9 12 死亡率（% 0 0 0 9.1% 33.3% 100% 平均死亡数（条） 0.318 平均死亡率（% 29.7% 计算出 24h 的 LC5o=1314.811 5、计算并分析CcT处理对环毛蚓SOD酶活的影响 1)邻苯三酚的自氧化速率 邻苯三酚自氧化速率 吸光值 计算可得A=0.053 2) CcT处理对环毛蚓SOD酶活的影响 各处理样品的邻苯三酚的自氧化

20、速率 SOD 1 2 3 平均E 每活性 2 5 1 o.do. o cd+处理浓度 (mg 匚1) 0(CK) 1/5LC50 1/3LC50 0.050 0.113* 0.150 0.0754 0.096 0.138 0.062 0.105 0.142 0.062 0.105 0.143 cd+处理对环毛蚓j Sod酶活的影响 5“处理浓度mg；Ll 1/： 0. 0. 2LC5O 197 184 201 194 0. 0. 分析：随着Cd2+处理浓度增加，环毛蚓SOD勺平均酶活性增加。因为SOD（超氧化物歧化酶）是生 物体内重要的抗氧化酶，具有特殊的生理活性，能消除生物体在新陈代谢过程中

21、产生的有害物质，所以 随着Cd2+浓度升高，环毛蚓体内代谢有毒物质的速度也越来越快，因此SOD酶活性越来越高。 6、蛋白质的测定 Cd2+处理浓度（mg L-1） 0(CK) 1/5LC50 1/3LC50 1/2LC50 体重（g） 0.44 0.42 0.36 0.47 蛋白浓度（g/L） 1.158 1.657 2.155 2.654 五、结论 本次实验的目的在于解毒理学研究中动物实验的常规操作方法和技术，了解测定一种未知的环境化 学物对生物体是否是安全的，必须进行哪些试验，获得哪些必要的数据；这些试验的基本步骤是什么， 试验数据应该如何处理等等。同时我们也了解了实验动物蚯蚓的生活习性和受试物氯化镉的理化性质， 和掌握了急性毒性试验以及测定相关的参数，如半数致死剂量，生长抑制效应等所需要的方法和步骤。 通过对蚯蚓染毒前后的性状比较可从表观上观察到重金属对有机体的巨大毒害作用，而通过计算蚯蚓体 内消除有毒物质的SODS活性，可充分认识到生物体对外来有毒物质的侵害做出的一系列应对措施。 近年来，随着人口增加及经济发展，我国面临的土壤环境安全问题越加突出。重金属和石油类的污 染，致使生态环境和农业生产受到极大破坏，作为土壤中大型动物蚯蚓的种群与数量同样发生了明显的 改变，这次蚯蚓的实验也更加让我们意识到土壤重金属防治迫在眉睫。