医用分子遗传学DNA复制课件

1、医用分子遗传学DNA复制1 第三章第三章 DNA 复制复制 (Replication of DNA) 医用分子遗传学DNA复制2 DNA DNA 复制一般特征复制一般特征 参与参与DNADNA复制的酶类复制的酶类 DNADNA复制基本过程复制基本过程 DNADNA复制的调控复制的调控 DNADNA损伤与修复损伤与修复 医用分子遗传学DNA复制3 一、一、DNA的生物学功能的生物学功能 1、储存遗传信息、储存遗传信息 2、复制遗传信息、复制遗传信息 3、表达遗传信息、表达遗传信息 4、遗传变异、遗传变异 1962, Nobel Prize1962, Nobel Prize 医用分子遗传学DNA复

2、制4 医用分子遗传学DNA复制5 全保留全保留 半保留半保留 分散式分散式 DNADNA如何进行复制？如何进行复制？ 医用分子遗传学DNA复制6 1515N N P0P0 P1P1 P2P2 P3P3 P4P4 P0P0P2P2 P0P0P4P4 1414N N 15 15N/ N/14 14N N 15 15N N Meselson-Stahl experimentMeselson-Stahl experiment 1958, PNAS1958, PNAS 医用分子遗传学DNA复制7 DNA的半保留复制的半保留复制 Semiconservative Replication DNA双链解开，以

3、单链做模板，碱基互补双链解开，以单链做模板，碱基互补 原则，各自合成一条链。在新合成的原则，各自合成一条链。在新合成的 DNA双链分子中，双链分子中，一条是原来的老链，一条是原来的老链， 一条是新链一条是新链。 第二代出现两条带，一条完全轻带一条中带第二代出现两条带，一条完全轻带一条中带 否定了分散式复制的可能，证明否定了分散式复制的可能，证明DNADNA只能是半只能是半 保留方式进行复制保留方式进行复制 医用分子遗传学DNA复制8 2 DNA2 DNA复制的半不连续性复制的半不连续性 复制时复制时DNADNA链延伸可能有三种方式：链延伸可能有三种方式： 1 1 2 2 3 3 1967196

4、7年，日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生年，日本科学家冈崎用实验证明复制过程中产生1001001000bp1000bp的短片段的短片段 没有从没有从3 3 5 5 延长延长 DNADNA链的聚链的聚 合酶合酶 医用分子遗传学DNA复制9 一条链连续合成，一条链连续合成，称称主导链主导链，Leading Leading Strand Strand 另另一条链分段合成一条链分段合成，称，称随从链随从链 Lagging StrandLagging Strand 。 原因：原因：DNADNA双螺旋分子两条链方向相反，新双螺旋分子两条链方向相反，新 链合成的方向只能链合成的方向只能5 533一个方向

5、合成。一个方向合成。 医用分子遗传学DNA复制10 在两个方向同时进行，形成两个复制叉在两个方向同时进行，形成两个复制叉 ( (Replication Fork ). 医用分子遗传学DNA复制11 医用分子遗传学DNA复制12 半保留半保留 半不连续性半不连续性 双向性双向性 医用分子遗传学DNA复制13 参与参与DNA复制的酶或蛋白因子：复制的酶或蛋白因子： 1 DNA聚合酶聚合酶 催化催化DNA的合成的合成 2 引物酶引物酶 起始起始RNA的合成的合成 3 连接酶连接酶 连接冈崎片段连接冈崎片段 4 DNA解链，解旋酶解链，解旋酶 5 DNA结合蛋白结合蛋白 医用分子遗传学DNA复制14

6、1956年，大肠杆菌年，大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 1959，Nobel Prize （一）（一） 作用机制作用机制 以以DNA做模板，碱基互补配对做模板，碱基互补配对 ，催化，催化4种种dNTP之间形成磷酸二之间形成磷酸二 酯键，从而延长酯键，从而延长DNA链。链。 医用分子遗传学DNA复制15 MgMg2+ 2+ 医用分子遗传学DNA复制16 在在模板模板链上进行链上进行 不能从头合成，在不能从头合成，在引物引物的的3 3OHOH端上延长端上延长 新链延长方向为新链延长方向为5 533延长延长 医用分子遗传学DNA复制17 有有3 3种：种：DNADNA聚合酶聚合酶 I I，IIII，II

7、IIII。 多功能酶多功能酶： 合成合成DNADNA的活性的活性 聚合酶作用聚合酶作用, ,延长延长DNADNA链。链。 水解水解DNADNA的活性的活性 外切核酸酶活性外切核酸酶活性, ,切除不配对切除不配对 碱基，起校读作用碱基，起校读作用 医用分子遗传学DNA复制18 大肠杆菌大肠杆菌DNADNA聚合酶聚合酶I I ： 单链多肽蛋白质单链多肽蛋白质, ,分子量为分子量为109KD.109KD. 性质：多功能酶性质：多功能酶 大亚基：大亚基：5 533聚合酶活性聚合酶活性 3 355外切酶活性外切酶活性 小亚基：小亚基：5 533外切酶活性。外切酶活性。 1000nt/min1000nt/

8、min 医用分子遗传学DNA复制19 3 355外切酶活性外切酶活性 从游离从游离3 3OHOH端切割端切割, ,识别和消除识别和消除 不配对的核苷酸，保证了不配对的核苷酸，保证了DNADNA复制的忠复制的忠 实性。实性。 5 53 3外切酶活性外切酶活性 DNADNA聚合酶聚合酶I I中的小亚基带有中的小亚基带有5 5外切外切 酶活性，从双链酶活性，从双链DNADNA的的5 5端降解释放出端降解释放出 单核苷酸或寡聚核苷酸。单核苷酸或寡聚核苷酸。 医用分子遗传学DNA复制20 医用分子遗传学DNA复制21 医用分子遗传学DNA复制22 医用分子遗传学DNA复制23 DNADNA聚合酶特有活性

9、聚合酶特有活性 医用分子遗传学DNA复制24 不是不是主要的复制酶主要的复制酶 RNARNA引物的切除引物的切除 DNADNA损伤的修复：紫外线作用形成的损伤的修复：紫外线作用形成的TTTT二二 聚体的切除聚体的切除 链置换：链置换： 可能参与遗传重组可能参与遗传重组 切口平移（切口平移（nick translationnick translation） 探针标记探针标记 医用分子遗传学DNA复制25 不是复制酶，主要在不是复制酶，主要在DNADNA修复中起作用，无修复中起作用，无 5 533外切酶活性。外切酶活性。 5% DNA5% DNA聚合酶聚合酶I I的活性的活性 医用分子遗传学DNA

10、复制26 1972 1972年发现年发现 催化效率高，主要复制酶。由催化效率高，主要复制酶。由1010种种亚基组成亚基组成： （1 1）核心聚合酶：）核心聚合酶： ：5 53 3DNADNA聚合酶活性聚合酶活性 ：3 3-5-5外切酶活性，控制外切酶活性，控制 复制忠实性复制忠实性 ：核心酶的组建：核心酶的组建 医用分子遗传学DNA复制27 （2 2） 二聚体：二聚体： 构成滑动钳，将全酶固构成滑动钳，将全酶固 定在定在DNADNA模板上，提高合成速率（模板上，提高合成速率（20/20/秒秒- - -750/-750/秒。秒。 （3 3） 复合物复合物 ： 2 2 协助协助 二聚体结合到二聚体

11、结合到 DNADNA 医用分子遗传学DNA复制28 E. coliE. coli DNA DNA 聚合酶聚合酶不对称二聚体不对称二聚体 医用分子遗传学DNA复制29 医用分子遗传学DNA复制30 形成不对称的二聚体，与形成不对称的二聚体，与DNADNA双链结合，后随双链结合，后随 链折叠链折叠1801800 0，使后随链的物理方向，使后随链的物理方向与主导链与主导链一一 致，同时催化两条链的复制。致，同时催化两条链的复制。 医用分子遗传学DNA复制31 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 3 3 5 5 解链方向解链方向 领头链领头链 (leading (leading stran

12、d)strand) 后随链后随链 (lagging strand)(lagging strand) 3 3 5 5 医用分子遗传学DNA复制32 医用分子遗传学DNA复制33 DNA DNA 聚合酶聚合酶 pol pol pol pol pol pol 亚基数目亚基数目 1 1 7 7 1010 5 5 3 3 聚合酶活性聚合酶活性 + + + + + + 3 3 5 5 外切酶活性外切酶活性 + + + + + + 5 5 3 3 外切酶活性外切酶活性 + + - - - - 聚合速度聚合速度( (核苷酸核苷酸/ /分分) ) 1 000-1 200 2 400 1 000-1 200 2

13、400 15 000-60 00015 000-60 000 持续合成能力持续合成能力 3-200 3-200 1 500 500 0001 500 500 000 功能功能 切除引物切除引物, ,修复修复 修复修复 复制复制 大肠杆菌大肠杆菌3 3种种DNADNA聚合酶性质比较聚合酶性质比较 医用分子遗传学DNA复制34 医用分子遗传学DNA复制35 DNADNA聚合酶聚合酶 : : 多亚基、多功能酶。多亚基、多功能酶。 大亚基：大亚基：DNADNA聚合酶活性。聚合酶活性。 100nt/100nt/次次 小亚基：引物酶活性，小亚基：引物酶活性，合成合成RNARNA。 起始起始DNADNA的合

14、成：合成的合成：合成RNARNA引物和在引物和在 RNA3RNA3羟基端合成一段羟基端合成一段DNADNA。 医用分子遗传学DNA复制36 DNADNA聚合酶聚合酶 的的结构结构 多亚基组成：多亚基组成： P125 P125 大亚基，催化亚基，含聚合酶和大亚基，催化亚基，含聚合酶和 外切酶活性外切酶活性 P50 P50 与增殖细胞核抗原与增殖细胞核抗原(PCNA)(PCNA)结合相关结合相关 P66P66 P12P12 医用分子遗传学DNA复制37 主要主要DNADNA复制酶：复制酶：DNADNA聚合酶活性，延伸聚合酶活性，延伸DNADNA链。链。 与与RFCRFC和和PCNAPCNA形成形成

15、“全酶全酶”，在，在RFCRFC和和PCNAPCNA 等的协同下，促使等的协同下，促使DNADNA聚合酶聚合酶 的解离的解离， DNADNA聚聚 合酶合酶 接替接替DNADNA聚合酶聚合酶 继续继续DNADNA链的合成链的合成- - DNADNA聚合酶聚合酶 向向DNADNA聚合酶聚合酶 的转换。的转换。 复制校正功能：复制校正功能：3 3-5-5外切核酸酶活性外切核酸酶活性 医用分子遗传学DNA复制38 DNADNA聚合酶聚合酶 、 主要功能：主要功能：DNADNA修复。修复。 DNADNA聚合酶聚合酶：线粒体：线粒体DNADNA复制复制 医用分子遗传学DNA复制39 1 1、PCNAPCN

16、A：增殖细胞核抗原（增殖细胞核抗原（ Proliferating Cell Nuclear Antigen)Proliferating Cell Nuclear Antigen) ， DNADNA聚合酶的附属蛋白，参与聚合酶的附属蛋白，参与DNADNA的合的合 成，类似成，类似 二聚体。二聚体。 2 2、RFCRFC：复制因子：复制因子C(Replication C(Replication Factor C)Factor C)。多亚基复合物，。多亚基复合物，DNADNA聚合酶聚合酶 的附属蛋白，的附属蛋白，识别引物末端识别引物末端, ,参与链的延参与链的延 长。类似长。类似 复合物。复合物。

17、医用分子遗传学DNA复制40 3、PRP1PRP1和和PRP2PRP2 Primer Recognition Protein 增加增加DNA聚合酶聚合酶 与模板引物末端的亲和力与模板引物末端的亲和力 ，增加，增加DNA聚合酶聚合酶 的活性。的活性。 医用分子遗传学DNA复制41 Taq DNA聚合酶特性聚合酶特性（Taq DNA polymerase） 最初由最初由H.A.ErlicH从热泉中的细菌中出来从热泉中的细菌中出来 性质性质 具有具有53聚合酶活性以及依赖于聚合作用的聚合酶活性以及依赖于聚合作用的 外切酶活性外切酶活性 耐热性耐热性 此酶是一种耐热的依赖于此酶是一种耐热的依赖于DNA

18、的的DNA聚合酶聚合酶 最适反应温度为最适反应温度为7280 应用应用 能以高温变性的靶能以高温变性的靶DNA分离出来的单链分离出来的单链DNA 为模板，进行为模板，进行DNA的体外扩增的体外扩增PCR反应。反应。 医用分子遗传学DNA复制42 DNA聚合酶不能引发聚合酶不能引发DNA新生链的合成，只新生链的合成，只 能能在在已存在的已存在的DNA链链或或RNA链上延长链上延长DNA。 引物酶催化引物引物酶催化引物RNA的合成。的合成。 医用分子遗传学DNA复制43 19671967年发现年发现 催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成，二个片段催化冈奇片段间磷酸二酯键的形成，二个片段 必须都与完整的模

19、板链结合。必须都与完整的模板链结合。 大肠杆菌的连接酶需大肠杆菌的连接酶需NAD+NAD+，真核细胞的连接酶真核细胞的连接酶 需要需要ATPATP。 可连接双链可连接双链DNADNA中的单链切口，中的单链切口，RNA-DNARNA-DNA杂交体杂交体 双链单链切口，不能连接双链双链单链切口，不能连接双链RNARNA中的单链切中的单链切 口。口。 医用分子遗传学DNA复制44 医用分子遗传学DNA复制45 （一）（一）DNADNA螺旋酶（螺旋酶（HelicaseHelicase） 催化双螺旋解旋和解链催化双螺旋解旋和解链 需消耗需消耗ATPATP 医用分子遗传学DNA复制46 （二）拓扑异构酶（

20、二）拓扑异构酶（Topoisomerase)Topoisomerase) DNA DNA 回旋酶（回旋酶（GyraseGyrase） 促进促进DNADNA双链的解开双链的解开, ,需消耗需消耗ATPATP。 兼有内切酶和连接酶活性兼有内切酶和连接酶活性, , 可迅速使可迅速使DNADNA 两条链断开又接上两条链断开又接上, , 消除解链酶产生的消除解链酶产生的 拓扑张力。拓扑张力。当引入负超螺旋当引入负超螺旋时需要由时需要由ATPATP 提供能量提供能量, , 同复制有关。同复制有关。 医用分子遗传学DNA复制47 医用分子遗传学DNA复制48 DNA单链结合蛋白（单链结合蛋白（Single

21、Strand Binding protein，SSB） 复制因子复制因子A 主要功能：主要功能： 与单链亲和力大，稳定单与单链亲和力大，稳定单 链结构，保护单链免受核酸酶水解和链结构，保护单链免受核酸酶水解和 阻止双链形成，有利复制进行。阻止双链形成，有利复制进行。 医用分子遗传学DNA复制49 医用分子遗传学DNA复制50 医用分子遗传学DNA复制51 医用分子遗传学DNA复制52 Replicon Replicon 基因组中能独立进行复制的基因组中能独立进行复制的 结构单位称复制子结构单位称复制子, , 或者说单个复制起或者说单个复制起 始点控制的始点控制的DNA,DNA,包含从起始位点到

22、终止包含从起始位点到终止 位点的全部位点的全部DNADNA。 复制的起始位点复制的起始位点 控制并起始复制的控制并起始复制的 特定位点。特定位点。 终止位点终止位点 终止复制的位点终止复制的位点 每个细胞周期启动复制一次。每个细胞周期启动复制一次。 医用分子遗传学DNA复制53 复制在复制在特定部位特定部位起始。起始。 原核生物仅有原核生物仅有一个一个起始部位。起始部位。 真核生物有真核生物有多个多个起始部位。起始部位。 医用分子遗传学DNA复制54 医用分子遗传学DNA复制55 医用分子遗传学DNA复制56 DNA拓扑异构酶解决了解开拓扑异构酶解决了解开DNA双螺双螺 旋的问题旋的问题 医用

23、分子遗传学DNA复制57 医用分子遗传学DNA复制58 一一 复制的起始复制的起始 （一）起始部位起始部位的序列特征的序列特征 同位素标记显示复制起始在特定部位开始同位素标记显示复制起始在特定部位开始 复制起始点复制起始点:origin, ori:origin, ori DNADNA复制过程：复制过程： 医用分子遗传学DNA复制59 1 1、 M M13 13噬菌体的起始部位顺序特征 噬菌体的起始部位顺序特征 5959bpbp的发夹结构的发夹结构 医用分子遗传学DNA复制60 2 2、大肠杆菌大肠杆菌(OriC)(OriC)的起始部位顺序特征的起始部位顺序特征 240bp240bp的唯一起始部

24、位的唯一起始部位 2 2个区域：个区域： 起始蛋白识别结合区起始蛋白识别结合区：4 4个个9 9bpbp重复顺序重复顺序 邻近的邻近的ATAT富含区富含区3 3个个1313bpbp重复顺序重复顺序。 医用分子遗传学DNA复制61 大肠杆菌基因组复制起始部位大肠杆菌基因组复制起始部位 医用分子遗传学DNA复制62 A: A: 含含ARSARS一致序列（一致序列（ACSACS），复制起始识别复合物结合），复制起始识别复合物结合 B B：增加复制起始位点的效率：增加复制起始位点的效率 100100200bp200bp 医用分子遗传学DNA复制63 5211 5220 5230 5240 1 10 2

25、0 30 CACTACTTCT GGAATAGCTCAGAGGCCGAGGCGGCCTCGGCC TCTGCATAAAT AAAAAAATTA GTGATGAAGACCTTATCGAGTCTCCG GCTCCG CCGGAGCCGGAGACGTATTTA T TTTTT TAAT 反转重复序列反转重复序列 大大T抗原结合部位抗原结合部位 II A/T 富含区富含区 图图3-7 SV40 复制起始部位结构复制起始部位结构 医用分子遗传学DNA复制64 独特重复序列独特重复序列 起始结合蛋白识别起始结合蛋白识别 ATAT富含序列，有利于富含序列，有利于DNADNA双链解旋双链解旋 医用分子遗传学D

26、NA复制65 多个复制起始点，有人发现任何大于多个复制起始点，有人发现任何大于15kb15kb的的 DNADNA就能自主复制。就能自主复制。 起始不是随机的，但未发现起始位点的特征序起始不是随机的，但未发现起始位点的特征序 列。列。 特征：结合复制相关蛋白特征：结合复制相关蛋白 一个细胞周期复制一次一个细胞周期复制一次 不同细胞复制起始位点的应用存在差异不同细胞复制起始位点的应用存在差异 医用分子遗传学DNA复制66 医用分子遗传学DNA复制67 1 噬菌体噬菌体（ X174X174） priA priA 识别起始位点，识别起始位点，ATPATP酶活性酶活性 priB priB 起始引发起始引

27、发 priC priC 起始引发起始引发 DnaT DnaT 起始引发起始引发 DnaB DnaB 起始引发起始引发 DnaC DnaC 起始引发起始引发, ,与与DnaBDnaB一起作用一起作用 DnaG DnaG RNARNA引物合成引物合成 医用分子遗传学DNA复制68 2 2 大肠杆菌大肠杆菌 DnaA DnaA 识别并识别并结合于结合于oriCoriC区区，有有ATPATP酶活性，使酶活性，使 ATAT富含区富含区解解链，促进链，促进DnaBDnaB结合形成起始复合物。结合形成起始复合物。 DnaB DNADnaB DNA螺旋酶，有解旋和解链作用。螺旋酶，有解旋和解链作用。 DnaC

28、 DnaC 运输运输DnaBDnaB，形成起始复合物。形成起始复合物。 DnaG DNADnaG DNA复制引发酶，合成引物。复制引发酶，合成引物。 Hu Hu 促进复制复合物的形成。促进复制复合物的形成。 回旋酶回旋酶 松弛正超螺旋，促进单链松弛正超螺旋，促进单链DNADNA产生。产生。 单链结合蛋白单链结合蛋白 促进促进DNADNA解链，稳定单链解链，稳定单链DNADNA。 医用分子遗传学DNA复制69 n site, primosome assembly site, n-pas 医用分子遗传学DNA复制70 真核细胞（真核细胞（SV40）的）的DNA复制至少需要复制至少需要6个蛋白因子参

29、与。个蛋白因子参与。 T抗原抗原：N N端为端为DNADNA结合区，识别起始位点，结合区，识别起始位点，C C端具有螺旋端具有螺旋 酶活性，在酶活性，在RFARFA的协助下解开双链。的协助下解开双链。 SV40 SV40 编码编码 RFA：人单链结合蛋白：人单链结合蛋白 拓补异构酶拓补异构酶I或或II：解开超螺旋。：解开超螺旋。 复制因子复制因子C（replication facter C, RFC）：形成起始复合物）：形成起始复合物 DNA聚合酶聚合酶-引物酶复合物：合成引物，起始引物酶复合物：合成引物，起始DNADNA合成。合成。 医用分子遗传学DNA复制71 医用分子遗传学DNA复制72

30、 （1） ORC（ Origin Recognition Complex） 6个亚基组成个亚基组成 在真核生物中相当保守在真核生物中相当保守 特异识别特异识别ARS （Autonomously replicating sequence） ORC1p，ORC2p，ORC4p 与与A 元件结合，元件结合， ORC5p与与B元件结合元件结合 结合过程需要结合过程需要ATP 医用分子遗传学DNA复制73 （2） Cdc6/Cdc18 （3）微染色体支持蛋白（）微染色体支持蛋白（Minichromosome maintenance proteins，MCMp） 与与DNA发生周期性的作用，与复制叉运动发生周期性的作用，与复制叉运动 有关。有关。 （4） Cdc45 与与DNA复制起始位点相互作用。复制起始位点相互作用。 医用分子遗