PCR反应及琼脂糖电泳实验报告

1、供参考多聚酶链式反应（PCR扩增DNA片段及琼脂糖凝胶电泳产物检测一、实验目的:1、了解PCR技术的基本操作2、理解PCR的原理3、讨论PCR的应用实验原理:PCF是 一种在体外模拟细胞内环境进行迅速扩增DNA片段的技术，这一技术需要模板、四种脱氧核苷酸等组分条件外，还需要不同温度环境以进行DNA的解旋和聚1、PCR反应组分细胞内DNA复制条件分析:条件参与的组分在DNAM制中 的作用实验条件/材 料模板DNA的两条单链提供复制的模板模板DNA原料四种脱氧核苷酸合成DNA子链 的原料dNTP mixture酶DNA聚合酶催化合成DNA 子链Taq DNA聚合 酶酶解旋酶打开DNA双链温度控制引

2、物一小段单链DNA或RNA为DNA聚合酶提供 合成的3 端起点引物I引物II此外，试验中用到的还有Mgcl2， Mg2+能激活酶的活性；10* Buffer 缓冲液，为 Taq酶提供合适的PH条件。2、PCR反应条件PCR利用了 DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合，现在使用的PCR仪实质上也是一台能够自动调控温度的仪器。PCR 般经历三十多次循环，每次循环可以分为三个基本步骤变性、复性和延伸。(!)变性(模板DNA解旋)模板DNA经加热至90 C以上。一定时间后，使模板DNA双链解离，使成为单链，以便于它与引物结合，为下轮反应作准备。(2) 复性(退火)模板DNA经加热变性

3、成单链后，温度降到50C左右，引物与模板 DNA单链的互补序列配对结合。(3) 延伸DNA模板-引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下以脱氧核苷酸为原料，以母链为模板,按碱基互补配对的原则与半保留复制的原理，合成一条新的DNA链。循环数变性复性延伸第一次(预变性)94 C,30s一一30次94 C,20s52C,20s72 C, 20s取后次(保 温)72 C, 30s3、PCR产物的检测(1) 紫外分光光度计DNA在 260nm的紫外波段有一强烈的吸收峰，可以通过与蒸馏水的对比进而计算扩增出 DNA的含量。(2) 琼脂糖凝胶电泳DNA在电厂作用下，可以由电源的负极向正极泳动，泳动的速度与

4、DNA片段的长度成负相关，与电压强度成正比，因此可以分离不同长度的DNA在有DNAmarker (不同已知碱基对大小的DNA片段的混合物)的条件下，由于不同碱基大小的 DNA片段在琼脂糖凝胶上涌动 的速度不同，因此电泳完毕后会出现在胶块的不同位置。通过将扩增出的 DNA片段与已知的条带做比较，可以大概推测出该片段的碱基对的大小。如果要进一步检测其大小，可以换另 外规格的DNA marker继续电泳。核酸荧光染料可以与 DNA嵌合，一起电泳，DNA图谱观察 仪可以激发特定的蓝色光源，荧光染料在该光照射下可见到荧光， 荧光的亮度与DNA大小成 正比。三、实验仪器及试剂7种PCF组分 微量可调移液器

5、 离心管PCR仪 水平电泳槽 电泳仪电源 紫外分光光度 计250ml锥形瓶（封口膜）记号笔 卫生纸四、实验步骤1、DNA体外扩增（1）将所有试剂管瞬时离心一次（4000r/min,1min ），使管壁没有残留药品，在引物 I和引物II的离心管内用移液器各加入 40ul双蒸水（ddHO），混匀后瞬时离心一次。所 有的离心管都摆到双面板上。向装有Taq DNA聚合酶的离心管按下表加入以下成分:10x Buffer50卩LMgCl250卩LdNTP mixture20卩L上游引物（引物I）25卩L下游引物（引物II）25卩L模板DNA25卩LddHzO290 卩 L原有的Taq DNA聚合酶有15u

6、l，此时混合液体系共计 500ul,此步骤由第一、二组同学 合作完成。（在实验老师的监督指导下操作，确保此后其他同学的实验顺利进行）（3）共分25组，第一、二组的同学并入其他小组进行实验。每组取 20ul的上述混合液 于0.5ml的离心管中，加入15ul的液体石蜡封闭体系，以防止在加热过程中蒸发。（4）对自己组的离心管上进行标记之后，放到PCF仪上进行DNA扩增。2、琼脂糖凝胶电泳检测DNA（1）用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子。（2） 配制浓度为1%（ 1 g/100 mL ）的琼脂糖凝胶2块。在锥形瓶中，称取 1g的琼脂 糖粉，加入100ml 1x电泳缓冲液，用封

7、口膜封住瓶口后在微波炉内加热，使琼脂糖粉熔化，然后冷却至60 C,倒入电泳槽中（每块胶50ml），插好梳子，待其凝固。（电泳槽首先用透明胶带将两端封住再进行倒胶）（3）待胶凝固后，去掉胶带纸，小心移去梳子，注意不要破坏加样孔。将倒胶槽至于 水平电泳槽内，梳井（点样孔）一端朝负极方向。向电泳槽中缓缓倒入 1x 电泳缓冲液，以 没过胶面2 mm为宜。（5）将 80ul 的 6xLoading Buffer 加入到 80ul 的核酸荧光染料中，按 1:1 比例混合。（6）移液器枪头插入到扩增出的样品离心管的底部，吸取20ul 样品于另一 0.5ml 的离心管中， 注意不要吸到液体石蜡， 再加 1ul

8、 的染料混合液， 充分振荡混匀。用移液器吸取 10ul 缓慢加入梳井内，枪头抵到梳井口，以防止样液被缓冲液冲散，此外，为防止手抖将 凝胶破坏，可以用左手扶住右手的手腕。（6） 盖上电泳槽盖，接通电源，电压为80 V ，电流最大。（7）当指示剂移动到凝胶中间时，断开电源，终止电泳。（8）取出凝胶块，在 DNA图谱观察仪中观察电泳带及其位置，判断扩增产物的情况。3、紫外分光光度计检测DNA含量（1）最后 1 组取 2ulPCR 反应液，加入 98ul 蒸馏水，将样品稀释 50 倍。（2 ）以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零。（3） 加入DNA稀释液100ul至比色杯中，测定 260nm处的光吸收值。（4）根据下面的公式计算 DNA含量：DNA含量（ul/ml ）=50*（ 260nm的读数）x稀释倍数五、注意事项1 离心机上盖没有锁，在离心机运转时，转速最高可达 16000r/min ，如果这时打