HIF-1作为作用靶点的肿瘤临床治疗研究

1、【论文关键词】HIF-1 ;肿瘤；调节机制；治疗靶点【论文摘要】本文结合HIF-1的结构和功能特点，详细综述了HIF-1对肿瘤血管生成的主要调节机制，对以HIF-1为作用靶点的肿瘤临床治疗前景作了简要展望。现代研究认为，恶性肿瘤的显著特征是肿瘤细胞的大量增殖和转移。其中，细胞大量增殖导致的组织缺氧是肿瘤的基本微环境，缺氧可以刺激肿瘤细胞一系列基因产物的表达诱导微血管生成，新生微血管不仅为肿瘤细胞带来营养成分，带走代谢产物，同时肿瘤细胞也可以通过新生的毛细血管发生转移。近年的研究表明1，缺氧诱导因子-1( hypoxia-induciblefactor 1， HIF-1 )可在基因水平上直接调控

2、血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor，VEGF )的表达，并促进肿瘤生长。本文就 HIF-1与肿瘤的相关性研究作一简要综 述。1 HIF-1 的结构和功能HIF-1最先由Semenza和Wang于1992年发现，将其作为被缺氧诱导的连接在EPO基因诱导元件上的一个核因子2。HIF-1是由a亚基和3亚基组成的异二聚体转录因子，由A、B、C、D四条链组成。其中 A、B链是DNA分子，均由14个碱基组成。C链 为3 亚基，与已知的芳香烃受体核转位蛋白(aryldrocarbon receptor nuclear translocator ,ARNT )

3、相同，其开放阅读框有 2367bp和2322bp2种，分别编码789和774个氨基酸，分 子量为80kD。D链是a亚单位，人类HIF-1 a基因定位于14q21-24 ,含有826个氨基酸， 分子量为120 kD ,是HIF-1的调节和活性亚基3。HIF-1 a和HIF-1 3的共同特点：N端 具有基本螺旋-环-螺旋(basic helix-loop-helix , bHLH )结构的碱性蛋白，其后紧随PAS(Per-ARNT-Sim )区域，bHLH和PAS区域主要介导异源二聚体的形成，以及负责与 DNA的缺氧反应元件(hypoxia response elements, HRE )结合4，

4、另外在 C端具有一个或多个 反式激活域(trans-activation domains , TAD ),负责与转录起始复合物结合参与转录活化5。HIF-1 a的C-TAD与N-TAD 之间576785位氨基酸序列为抑制结构域，能降低TAD的活性，在常氧细胞中该抑制明显。另外，HIF-1 a还包含两个核定位信号 (nuclear localizationsignal, NLS ) : N-端核定位信号和 C-端核定位信号，C-NLS在HIF-1 a核定位方面发挥更 为重要的作用。HIF-1 a常氧状态下极不稳定， 半衰期小于510分钟，Hua ng LE等1998 年发现，在HIF-1 a 4

5、01603区域， 有一个氧依赖降解区(oxygen-dependent degradationdomain , ODD),其中一部分与 N-TAD重合，负责HIF-1的降解。当环境氧的浓度超过5%时，通过激活泛素-蛋白酶体路径，作用于 HIF-1 a的ODD区，使其迅速降解。如果截去 ODD区，可以使HIF-1 a在有氧状态下保持稳定，并且仍可与ARNT形成二聚体及与 DNA 结合，此时即使环境不缺氧，它也具有完整的转录活性。HIF-1 a羧基端含有PEST-样基序，因富含脯氨酸、谷氨酸、丝氨酸和苏氨酸，其主要作用是加速常氧下ODD介导的HIF-1a蛋白经泛素-蛋白酶复合体途径降解。HIF-1

6、的两个亚单位中，HIF-I 3与细胞的多种功能有关而不仅限于 O2代谢，HIF-1 a则仅与O2代谢有关。HIF-1 3在细胞中组成性表 达，而a亚基是HIF-1的调节和活性亚基。HIF-1 a蛋白常氧状态下极不稳定，但能在缺 氧条件下保持稳定，并且是组织缺氧的内在标志7。2 HIF-1调节肿瘤血管生成的相关机制大量的研究表明，在多数恶性肿瘤组织内，HIF-1都有一定程度的表达，然而，HIF-1在不同肿瘤中高表达的机制不尽相同，而这些不同的机制下诱导的HIF-1的表达参与了肿瘤的不同的恶性生物学行为。Birnal等8进一步研究发现 HIF-1 a的表达亦与肿瘤细胞的增殖、浸润及转移能力相关，其

7、表达越高，预后越差。大量新生血管形成及糖酵解增强是实质性恶性肿瘤的两个主要特征，正是这两个特征使得肿瘤细胞能够适应缺氧环境。HIF-1下游基因既参与血管生成， 又参与无氧糖酵解， 因此，HIF-1在瘤细胞适应缺氧环境过程中起中 心介导作用，是诱导肿瘤血管生成的核心分子9。HIF-1调节血管生成的主要机制可分为VEGF依赖途径和 VEGF非依赖途径两类。2.1 VEGF依赖途径HIF-1通过诱导 VEGF表达，特异地结合位于血管内皮细胞上的特异受体Flt-1和KDR，促进内皮细胞生长，增加血管通透性，进而促进血管生成。VEGF是血管生长的主要因子，各种类型细胞中 VEGF的表达随氧气浓度的降低而

8、升高，如低氧培养的细胞 VEGFmRNA水平和蛋白明显升高，恢复正常氧张力时则回降；坏死区周围肿瘤细胞的VEGFmRNA呈高度表达，说明局部低氧是肿瘤微环境内VEGF基因表达的主要诱因。Maxwell等10在小鼠皮下种植HIF-1 3突变的肝癌细胞，发现移植瘤生长缓慢，免疫组化示微血管 密度显著减少，采用原位杂交技术发现VEGF mRNA表达近缺失。Ravi等11发现经转染HIF-1 a表达载体的HCT116结肠癌细胞，VEGF蛋白表达显著增加，异种移植瘤生长速度 加快，血管化作用增强。研究发现，HIF-1通过增强VEGF的转录活性与增加 VEGFmRNA 稳定性两个方面调节 VEGF的稳定表

9、达12。进一步研究表明，HIF-1对VEGF的调控首 先在于其与HRE的结合，激活C-TAD ,使之与p300/CBP环腺苷酸反应元件结合蛋白CH1的结合力增强，通过此核磷酸蛋白将转录信号传递给VEGF基因，促进VEGF的转录及表达13。体外细胞培养表明，通过转基因手段强制表达HIF-1后，在低氧和正常氧分压条件下VEGF的表达均明显增加。有研究表明，去除VEGF的增强子或诱导 HIF-1结合位点序列内出现点突变则 HIF-1对VEGF调控作用就不复存在，此时VEGF mRNA水平显著降低，即使在低氧条件下，VEGF mRNA也未被诱导表达14, 15。另外，缺氧状态下 VEGFmRNA 5

10、非转录区存在内部核糖体插入位点(internal ribosome entry site , IRES),能保护VEGF mRNA 进行蛋白质翻译16。这些表明HIF-1在VEGF mRNA 的稳定表达方面起到 了一定作用。另外，HIF-1可以上调VEGF受体Flt-1的转录，Flt-1的大量表达，加强了 VEGF的生物学效应17。最新研究还提示，VEGF mRNA的3 非转录区富含腺核苷酸 - 鸟核苷酸(AU )，缺氧时高表达的 RNA结合蛋白HuR与富含AU的元件具有特别亲和力， HuR则可使VEGF mRNA 在有氧状态下也不被降解，HuR表达与HIF-1密切相关18。2.2 VEGF非

11、依赖途径VEGF非依赖途径主要是 HIF-1通过促进其他因子表达或癌基因发生作用19。体外细胞实验证实，HIF-1可诱导人内皮细胞环氧合酶 -2 ( COX-2 )的表达，而 COX-2及其合成 产物前列腺素等可通过除VEGF以外的碱性成纤维细胞生长因子、血小板源生长因子、表皮生长因子及胰岛素样生长因子等多种途径调节血管生成。国内学者分别将合成的具有HIF-1特异结合位点的 DNA片段红细胞生成素 3-增强子(EPO 3-enhancer)及HIF-1结合 位点突变的 DNA片段，经脂质体包裹转入鼠主动脉内皮细胞与肺微血管内皮细胞，应用RT-PCR对COX-2的表达进行半定量观察。发现在缺氧时

12、，主动脉和微血管内皮细胞 COX-2 的表达都有增加，但经转入EPO 3DNA片段的内皮细胞，缺氧对 COX-2的诱导作用被显著减弱，转入将 HIF-1结合位点突变的 DNA片段则无此抑制作用。据此推测缺氧诱导 COX-2表达时，HIF-1在其信息传递中可能起着关键作用。氯化钻(CoCl2 )是特异性的HIF-1诱导剂，在其作用下体外培养的人脐静脉内皮细胞COX-2 mRNA 水平显著提高，提示CoCl2可使COX-2基因转录明显增强，而向细胞导人 EPO 3-增强子野生片段可阻断 CoCl2诱导的COX-2转录，若导入点突变片段则无阻断作用。进而推断COX-2基因序列中可能存在类似的 HIF

13、-1结合序列，HIF-1诱导COX-2基因表达增强可能主要通过HIF-1与该序列的结合实现，由于 EPO 3-增强子片段对HIF-1竞争性结合抑制，导致被转入细胞对 缺氧反应的减弱。Naomoto等20的研究也证实了 HIF-1 a可能通过COX-2途径在多种肿瘤的血管生成中起重要作用。但是缺氧条件下，HIF-1调节肿瘤血管生成还是以VEGF依 赖途径为主。3 HIF-1与肿瘤治疗肿瘤组织内的缺氧环境可以诱导HIF-1 a的表达，继而诱导下游多种靶基因的转录和表达增强，尤其 HIF-1诱导VEGF表达途径，在促使肿瘤的微血管的生成，肿瘤细胞的生 长代谢以及恶性转化过程中起到了重要的枢纽作用。目

14、前，HIF-1 a在肿瘤治疗方面的研究大致可分为药物治疗和基因治疗两类。接下来我们结合这两种研究思路，总结并展望一下以HIF-1为靶点的肿瘤治疗前景。3.1药物治疗目前，正在研究的抑制HIF-1活性药物大体可分为两类：阻断相关信号转导通路；小分子HIF-1活性抑制剂。可溶性鸟苷酸环化酶抑制剂YC-1能够有效抑制HIF-1 a表达，且能够抑制 VEGF的表达，减弱血管化作用21。热休克蛋白90抑制剂格尔德霉素，通过抑制热休克蛋白 90与HIF-1 a结合而使HIF-1 a稳定性消失22。苯甲酸类似物是一 类新的HIF-1抑制剂，能够有效地抑制缺氧时人类肝癌Hep3B细胞中HIF-1 a蛋白集聚和

15、其靶基因的表达23。雷帕霉素可通过下调HIF-1 a和VEGFmRNA的水平而抑制肝癌的生长和转移24。非甾体消炎药和缺氧性细胞毒素TX-402，亦可通过阻断或抑制HIF-1的表达来抑制血管生成。在脑胶质细胞瘤中，一种新发现的小分子 HIF-1 a抑制剂103D5R25以及ras癌基因抑制剂26，可通过减少HIF-1 a蛋白合成而抑制其下游靶基因的表达。最新研究表明，组蛋白脱乙酰基酶抑制剂丁酸钠在低氧环境下，能够通过抑制HIF-1介导的血管生成抑制 HT1080人纤维肉瘤细胞的生长27。3.2基因治疗肿瘤的基因治疗的关键在于肿瘤特异性的载体的开发，通过其结合肿瘤特异性表位以实现基因治疗。Rua

16、n把自杀基因Bax反义RNA导入HRE的下游，在缺氧状态下转染了自杀基因质粒的细胞优先凋亡28。另外可以通过利用反义RNA来抑制HIF-1的活性，利用 RNA干扰配合放疗29。反义HIF-1 a可能通过阻断HIF-1 a和 survivin的表达而增强胰腺癌对化疗的敏感性30。酪蛋白激酶2 (CK2) siRNA可通过升高p53蛋白水平降低缺氧时HIF-1活性31。利用表达pshHIF-1 a (plasmid DNA expressingshort hairpin RNA targeting HIF-1 a )的质粒 DNA 转染 Colon26 和 B16-BL6 细胞，能在体 外有效抑制

17、HIF-1 a的表达，且经门静脉注入 pshHIF-1 a至荷瘤鼠肝脏中，正常肝细胞和肿瘤细胞HIF-1 a蛋白表达均降低，通过沉默正常和肿瘤细胞中HIF-1 a表达，抑制肝转移瘤生长可成为新的治疗方法32。出师表两汉：诸葛亮先帝创业未半而中道崩殂，今天下三分，益州疲弊，此诚危急存亡之秋也。然侍卫之臣不懈于内，忠志之士忘身于外者，盖追先帝之殊遇，欲报之于陛下也。诚宜开张圣听，以光先帝遗德，恢弘志士之气，不宜妄自菲薄，引喻失义，以塞忠谏之路也。宫中府中，俱为一体；陟罚臧否，不宜异同。若有作奸犯科及为忠善者，宜付有司论其刑赏，以昭陛下平明之理；不宜偏私，使内外异法也。侍中、侍郎郭攸之、费祎、董允等，此皆良实，志虑忠纯，是以先帝简拔以遗陛下：愚以为宫中之事，事无大小，悉以咨之，然后施行，必能裨补阙漏，有所广益。将军向宠，性行淑均，晓畅军事，试用于昔日，先帝称之曰能”，是以众议举宠为督：愚以为营中之事，悉以咨之，必能使行阵和睦，优劣得所。亲贤臣，远小人，此先汉所以兴隆也； 亲小人，远贤臣，此后汉所以倾颓也。 先帝在时, 每与臣论此事，未尝不叹息痛恨于桓、 灵也。侍中、尚书、长史、参军，此悉贞良死节之臣， 愿陛下亲之、信之，则汉室之隆，可计日而待也。臣本布衣，躬耕于南阳，苟全性命于乱世，不求闻达于诸侯。先帝不以臣卑鄙，猥自枉 屈，三顾臣于草庐之中，咨臣以当世之事