甲烷氧化菌20Z利用EMP途径高效同化甲烷汇总

1、生 物 工 程 学 报崔金玉等/甲烷氧化菌20z利用embden-meyerhof-parnas途径高效同化甲烷，43chinese journal of biotechnology/cjbcnjanuary 25, 2014, 30(1): 43- 54doi: 10.13345/j.cjb.130375?2014 chin j biotech, all rights reserved细胞工厂与发酵工程甲烷氧化菌20z禾ij用embden-meyerhof-parnas 途径 高效同化甲烷崔金玉1,姚陆1,孙效乐2, marina g. kaly

2、uzhnaja杨松1,41青岛农业大学生命科学学院山东省应用真菌重点实验室，山东 青岛2661092山东省农业科学院质量标准与检测试验研究所，山东 济南2501003美国华盛顿大学微生物系，华盛顿州西雅图981054天津大学系统生物工程教育部重点实验室，天津300072崔金玉，姚陆，孙效乐，等.甲烷氧化菌 20z利用embden-meyerhof-parnas 途径高效同化甲烷 .生物工程学报，2014, 30(1): 43 - 54.cui jy, yao l, sun xl, et al.highly efficient methane assimilation through embde

3、n-meyerhof-parnas pathway inmethylomicrobium alcaliphilum 20z. chin j biotech, 2014, 30(1): 43- 54.摘要：为了探究 丫变形菌纲(gammaproteobacteria) 甲烷氧化菌 methylomicrobium alcaliphilum 20z 的甲烷 同化代谢过程。文中整合rna-seq、lc-ms技术并结合13c标记策略对核酮糖单磷酸途径(ribulose monophosphate pathway) 及下 游途径展开系统组学分析。m. alcaliphilum 20z 代 谢物组定量分析

4、表明 entner-doudoroff (edd) 途径的中间代谢物 6-磷酸葡萄糖的浓度是 (150.95 28.75)心矶山酮-3-脱氧-6-磷酸 葡糖酸浓度低于质谱定量分析检测限，而 embden-meyerhof-parnas (emp) 途径中果糖1,6-二磷酸、甘油醛-3- 磷酸/二羟丙酮磷酸和磷酸烯醇式丙酮酸的浓度分别是(1 142.02 士 302.88)、(1 m66176士 388.55) 穗 mol/l(3 067.57 898.13) mofuli edd和emp途径的代谢物13c同位素动态富集研究，进一步揭示3位标记丙酮酸丰度是1位标记丙酮酸丰度的 46倍。最后，基因

5、表达比较分析发现emp途径的关键基因(如：fbaa、tpia、gap和pyka)的表达水平(rpkm) 分别是2 479.2、2 493.9、2 274.6和1 846.0,而edd途径中基因 (如： pgi、eda 和 edd)的 rpkm 仅是 263.8、341.2 和 225.4。综合上述结果阐明emp 途径才是 m. alcaliphilum 20z进行甲烷同化的关键通路。emp途径代谢功能的全新iw述不但改变对gammaproteobacteria甲烷氧化菌甲烷同化模式的传统认知，而且为甲烷高效生物催化转化提供重要的理论基础。关键词：甲烷氧化菌，甲烷同化途径，甲烷生物催化，13c标

6、记代谢物组，转录物组received : july 24, 2013; accepted : october 8, 2013supported by : the usa department of energy (no. de-sc0005154), open funding project of the key laboratory of systems bioengineering, ministry of education of china, and start-up funding of high-level talent at qingdao agricultural univer

7、sity (no. 1312). corresponding author : song yang. tel/fax: +86-532-88030327; e-mail: 美国能源部基金(no. de-sc0005154),中国系统生物工程教育部重点实验室开放课题基金，青岛农业大学高层次人才启动基金(no. 1312)资助。网络出版时间： 2013-11-27网络出版地址：http:/kcms/detail/11.1998.q20131127.1120.005.htmlissn 1000-3061cn 11-1998/q chi

8、n j biotech january 25, 2014 vol.30 no.1highly efficient methane assimilation through embden-meyerhof-parnas pathway in methylomicrobium alcaliphilum 20zjinyu cui 1, lu yao1, xiaole sun2, marina g. kalyuzhnaya 3, and song yang1,41 shangdong province key laboratory of applied mycology , school of lif

9、e sciences, qingdao agricultural university , qingdao 266109, shandong, china2 institute of quality standards and testing , shandong academy of agricultural sciences , jinan 250100, shandong, china3 department of microbiology , university of washington , seattle, wa 98105, usa4 key laboratory of sys

10、tems bioengineering , ministry of education , tianjin university , tianjin 300072, chinaabstract: in order to understand metabolic functions essential for methane assimilation, we investigate dribulose monophosphate pathway and adjacent pathways in gammaproteobacterial methylomicrobium alcaliphilum

11、20z by using combined approaches of rna-seq, lc-ms, and 13c-labeled techniques. the absolute quantification of metabolome showed that the concentrations of intermediates, such as glucose-6-phosphate and 2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconate, involved in entner-doudoroff (edd) pathway were (150.95+ 28.7

12、5) g mol/l and below the limit of detection of massspectrometry. in contrast, fructose-1,6-bisphosphate, glyceraldehyde-3-phosphate/dihydroxyacetone and phosphoenolpyruvate in embden-meyerhof-parnas (emp) pathway hadsignificantly higher concentrations with(1 142.02 + 302.88) g mol/l, (1 866.76+ 388.

13、55) g mol/l and (3 067.57+ 898.13) g mol/l, respectively. 13c-labelingexperiment further indicated that the enrichment of 3-13c1-pyruvate involved in emp pathway was 46 fold higher than1,13c1-pyruvate in edd pathway in a dynamic course. moreover, gene expression profile showed that the expression le

14、vels of genes in emp pathway (e.g. fbaa, tpia, gap and pyka) were 2 479.2, 2 493.9, 2 274.6 and 1 846.0, respectively, but gene expressionlevels in edd pathway (e.g. pgi, eda and edd) were only 263.8, 341.2 and 225.4, respectively. overall our current results demonstrated that emp pathway was the ma

15、in route for methane assimilation in m. alcaliphilum 20z.this discovery challenged our understanding of methane assimilation pathway in gammaproteobacterial methanotrophic bacteria, and further provided an important insight for efficient methane biocatalysis in the future.keywords : methanotrophs, m

16、ethane assimilation, methane biocatalysis, 13c-labeling metabolomics, transcriptomics/cjbcn甲烷(ch 4)是驱动全球气候变暖的重要温 室气体，同时甲烷作为天然气和沼气的主要成 分不但是高价值燃料资源，也是一碳化工的重 要前体原料1-2。近年来，探讨如何有效实现甲 烷催化转变成化学产品成为国内外化工领域关 注的热点课题之一 3-4。甲烷氧化菌是迄今为止 发现的唯一能以甲烷作为生长碳源和能源的生 物体。gammaproteobacteria 甲烷氧化菌利用核酮

17、糖单磷酸途径(ribulose monophosphate pathway , rump)同化代谢甲烷， 是实现甲烷高 效生物催化转化的最有前景微生物系5-6。然而除了单细胞蛋白和聚伊羟基丁酸 (poly- 3-hydroxybutyrrate) 7-8,目前基于甲烷的 生物催化转化合成高附加值产品的成功研究还 没有报道过。其中一个主要原因是甲烷氧化菌 基因组和后基因组的信息缺少、代谢网络信息 崔金玉 等/甲烷氧化菌 20z利用embden-meyerhof-parnas 途径高效同化甲烷49不完整，阻碍对甲烷氧化菌合理而有效的代谢 工程改造。甲烷氧化菌 methylomicrobium al

18、caliphilum 20z是一株代表性的中性嗜盐、嗜碱 gammaproteobacteria菌，其生长速率较快且稳9-10定，是具有广泛应用前景的甲烷催化系统。2011年，m. alcaliphilum 20z基因组测序诠释获 得完成，为进一步从系统水平上阐明 m. alcaliphilum 20z的基因组功能、代谢网络调 控机制及代谢工程改造奠定重要的理论基础11。传统生物化学和酶学研究一直认为 gammaproteobacteria 甲烷氧化菌主要利用 rump 途径的 entner-doudoroff pathway (edd) 分支途径进行甲烷氧化产物甲醛的同化吸收， 而另一途径

19、embden-meyerhof-parnas (emp)是 旁支代谢路径。然而，最近基因组分析显示所 有参与 emp 途径代谢反应的基因都在 m. alcaliphilum 20z 基因组中存在11。而且对 gammaproteobacteria 嗜 甲烷菌 methylococcus capsulatus bath蛋白物组分析也表明edd途径和emp途径的催化酶在 m. capsulatus bath中适 量表达12。考虑到rump途径中的emp途径比 edd途径能更高效吸收利用甲烷13,深入探究emp途径在gammaproteobacteria甲烷氧化菌中 真正的代谢功能，就成为理解甲烷同

20、化吸收过 程和实现甲烷高效生物转化的关键所在。本研究以阐述 m. alcaliphilum 20z 的中心代谢网络特征为核心，利用 rna-seq、lc-ms 13 技术并结合c标记策略，深入探讨细胞的转录物和代谢物两个层次特征，揭示m. alcaliphilum20z中emp途径是参与甲烷同化的重要代谢过 程。本研究结果对代谢工程改造 gammaproteobacteria 甲烷氧化菌高效转化甲烷 合成高附加值产品具有十分重要的科学意义。1材料与方法1.1 菌种甲基营 养杆菌 methylotrophic extorquens am1 和 methylomicrobium alcaliphi

21、lum 20z 由美 国华盛顿大学 mary e.lidstrom课题组赠送。1.2 试剂氨基酸、有机酸和糖磷酸等12c-标记标准品是分析级，购买于 sigma公司(st. louis, mo, usa)。乙醇从 emd chemicals 公司购买 (gibbstown, nj, usa)。液相色谱使用是lc-ms级溶剂(fisher scientific, fair lawn, nj, usa) 。 超纯水由 millipore q reference 制备。13c标记 甲醇(99%) 和13c标记甲烷分别购买于 cambridge isotope laboratories 公司 (and

22、over, ma, usa)和 sigma 公司。1.3 methylotrophic extorquens am1 和 methylomicrobium alcaliphilum 20z 的培养 1.3.1 m. extorquens am1 分批培养和以 13c 标 记甲醇为碳源的连续恒化培养m. extorquens am1 在 250 ml 锥形瓶中进 行液体分批培养，甲醇作为碳源，卡那霉素浓 度是50闻/ml ,培养温度28 c ,具体培养方法 参见文献14。n. extorquens am1 在 1 l 发酵罐 (bioflo110 , new brunswick scientif

23、ic, edison, nj, usa)中连续恒化培养。连续培养的无机盐组分 与分批培养相同，25 mmol/l 13c标记甲醇作为碳 源。培养过程中，为除去空气中的co2,将压缩空气通过 3个串联的内含有 1 l koh (4 mol/l) 溶液的锥形瓶。恒化培养稀释率 d= 0.1 h , od600=1.0 0,15个培养周期后收集细胞。 1.3.2 m. alcaliphilum 20z 的培养o. alcaliphilum 20z培养在改良 nms培养10基上 ,含有 3% nacl , 0.25g kno 3, ph 为 8.9, 甲烷浓度是 35% (v/v),摇床转速是 250

24、 r/min , 培养温度是30 c ,气相色谱火焰离子化检测器 检测甲烷消耗浓度。1.4代谢物组的制备1.4.1 13c标记内标代谢物的制备10 ml 13c 标记 m. extorquens am1 细胞培养 液小心、快速转移至28 ml冷浸液中(hepes(70 mmol/l, ph 6.8), 60% 甲醇 (v/v)溶液，-40 ),低温冷冻离心(dupont sorvall rc5b, waltham, ma, usa),弃去上清液，沉淀细胞颗粒 重新溶解于同样的冷浸溶液中，并在10 000 r/min下再次离心6 min ,接着提取13c标记内标代谢 物。提取核甘酸、有机酸、氨基

25、酸和糖磷酸的 方法参见文献15。对于酰基辅酶，使用文献15 中的酸提取方法。将所有13c标记的细胞提取物合并、稀释和分装在 -80下贮存，待用。1.4.2 m. alcaliphilum 20z代谢物组的样品制备6 ml ( od600 =0.4 0.2)的细胞，按照上述方 法进行冷浸，接着在提取代谢物组前，将 905 的13c标记内标代谢物快速添加到细胞中，代谢物组提取方法参考文献15,所获样品溶解在100 l的超纯水中待分析。1.5 lc-ms分析代谢物组lc-ms 是在 waters (milford, ma, usa) 系 统上进行。lc-ms系统由1525科的高效液相色 谱泵、277

26、7c自动进样器及quattro micro api质谱仪(micromass, manchester, uk) 组成。液相 色谱分离采用hilic模式，色谱柱是 luna nh 2(250 mm x 2 mm, 5 pm, phenomenex),具体方法 参见文献16,质谱扫描模式是多反应监测 (mrm)。代谢物峰用 masslynx quanlynx applications manager (version 4.1) 软 件进行分析。1.6 标准曲线的建立4山不同浓度的12c标记标准品添加到已 制备好的36山13c标记内标代谢物中，最终12c标记标准品的浓度分别是200、500、1 00

27、0、2 500、5 000、10 000、25 000、50 000 nmol/l 。以 12c 标准品峰面积和13c标记内标代谢物峰面积的一12比值作为纵坐标，以 c标准品浓度作为横坐 标，构建标准曲线，进而计算拟合方程和r2,具体方法参见文献15。1.7 13c标记动态代谢物组分析m. alcaliphilum 20z 在指数生长中期 (od600 =0.25 0.05)转移到新培养瓶中，并快速 13 添加相应浓度ch4 (纯度是99.9%),样品在时间点(0、1、3、5、10、20、40 min)进行收集、 提取和保存，具体方法参见1.4。1.8 转录物组分析45 ml m. alcal

28、iphilum 20z 培养液 (od600 =0.30 0.05)添加到 5 ml 停止液 (含 5% 苯酚)中，总rna/dna 的提取方法参考文献 17 , rneasy mini kit 和 microexpress kit 用 来纯化 rna和富集 mrna , 1%琼脂糖凝胶电 泳和 agilent 2100 bioanalyzer 分析提取的 rna 质量。rna-seq在美国华盛顿大学基因组测序 中心完成，测序平台为illumina高通量深度测序。测序读段(reads)利用 burrows-wheeler transform 算法和 m. alcaliphilum 20z 参考

29、基因 组比对和定位。利用 cufflinks软件计算在基因 组上定位读段的数量即 rpkm (reads per kilobase of gene per million mapped reads) , rpkm是每百万读段中来自某一基因每千碱基 长度的读段数目。9rpkm=基因压读段计数x 10/（基因长度 x测序深度），具体分析方法参见文献17。2结果与分析2.1 m. alcaliphilum 20z 中心代谢网络的代 谢物浓度定量代谢物浓度影响代谢反应的方向和代谢反应的速率，因此准确定量代谢物是解析 m. alcaliphilum 20z代谢网络特征白重要元素，是和其他微生物系进行比较

30、分析的基础。由于 代谢物组样品成分复杂，代谢物在质谱离子源 离子化过程中存在显著差异性，并且离子间存在抑制效应，因此13c标记内标彳t谢物（13c-is）的添加是矫正质谱分析和样品制备过程中出现 误差的重要方法15。然而商业化13c-is稀缺且价格昂贵，本研究首先利用甲基营养菌 m. extorquens am1生物合成 13c-is ,进而将合 13成的 c-is添加到 m. alcaliphilum 20z的代谢物 提取液中，以提高m. alcaliphilum 20z胞内代谢 物浓度定量的准确性。选择m. extorquens am1菌合成13c-is是因为其代谢物组成分及代谢网 络 结

31、构 和 m. alcaliphilum 20z 相似，而且 m. extorquens am1生长更快速。图 1显示m. alcaliphilum 20z代谢物组绝对定量流程。air l2c standards mixture0.21510 50nmul/lykoh财，alcaliphilum 20z grcwn 廿am iderived l1c i.s.+i2c13crc图1甲烷氧化菌 m. alcaliphilum 20z的代谢物组绝对定量流程fig. 1 workflow of absolute quantitation of etabolome inm

32、. alcaliphilum 20z. a: bioreactor cultivation ofm. extorquens am1 grown on 13c-methanol to obtain 13c-is; b: the development ofcalibration curve on lc-ms; c: the measurement of intracellular pool of m. alcaliphilum 20z based on m. extorquens am1 derived 13c-is.issn 1000-3061cn 11-1998/q chin j biote

33、ch january 25, 2014 vol.30 no.1表 1 是 m. alcaliphilum 20z 的 24 个中心代 methylosinus trichosporium ob3b 的中心代谢物 谢物浓度的定量结果。与我们前期研究报道%浓度相比较18,丝氨酸循环途径(serine cycle)的变形菌纲 (alphaproteobacteria)甲烷氧化菌中间代谢物，如甘氨酸(glycine)、丝氨酸(serine)表1 m. alcaliphilum 20z和m. trichosporium ob3b胞内中间代谢物浓度的比较分析 table 1 comparison of i

34、ntracellular pool of key metabolites betweenm. alcaliphilum 20z andm. trichosporium ob3bm. alcaliphilum 20z m. trichosporium ob3bmetaboliteconcentration ( gol/l)ribulose-5-phosphate/ribose-5-phosphate859.0+201.7140.6 57.1fructose-1,6-bisphosphate1 142.0 坟2.9136.4 37.6fructose-6-phosphate/glucose-6-p

35、hosphate4 297.8 i352.22 836.0 654.3glyceraldehyde-3-phosphate/dihydroxyacetone1 866.8 i388.61 968.6 509.6phosphoglycerate4 050.8 与99.5811.9 118.3phosphoenolpyruvate3 067.6 i898.1661.5 103.4pyruvate4 607.5 1 304.31 134.7 +299.36-phosphogluconic acid151.0 立8.8n/ab2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconatetrac

36、ean/a bacetyl-coa291.2 毛7.4519.3 162.9succinate770.9 +232.81 304.4 323.9malate1 832.6 珈3.4950.2 154.7fumarate190.1 0.0400.5 85.7citrate917.0+227.63 149.2 528.1alanine2 927.2 均55.64 495.5 +766.2glycerate454.8 g3365.4 划1.8glycine5 025.5 1 002.14 631.9 +484.1serine1 001.7 91.51 504.9 +142.0aspartate11

37、503.2 937.61 998.0 +481.7glutamate18 907.4 立 945.724 034.1 划 060.4glutamine7 834.7 1 521.59 864.0 立 457.3a: metabolite concentration is below 10gol/l; b: not available./cjbcn崔金玉 等/甲烷氧化菌 20z利用embden-meyerhof-parnas 途径高效同化甲烷57和甘油酸(glycerate)的浓度没有显著变化。在三 竣酸(tricarxylic acid cycle

38、 , tca)循环途径中， 由草酰乙酸 (oxalaceticacid , oaa)合成游离氨 基酸天冬氨酸(aspartate),在 m. alcaliphilum 20z中天冬氨酸的浓度是m. trichosporium ob3b的5.8倍，该结果与m. alcaliphilum 20z在高盐环境下生长积累的四氢甲基喀咤竣酸关联10。在 m. alcaliphilum 20z 中，果糖 1, 6-二磷酸 (fructose-1,6-bisphosphate , fbp)、核酮糖 5-磷 酸(ribulose 5-phosphate , ru5p)、磷酸烯醇式 丙酮酸(phosphoenol

39、pyruvate, pep) 浓度分别 是 m. trichosporium ob3b 的 8.4 倍、6.1 倍和 2.7 倍，该结果与rump途径是m. alcaliphilum 20z进行甲烷同化吸收的主要代谢途径的观点相一致。此夕卜，近来在 m. extorquens am1 和 m. trichosporium ob3b 中分别发现新颖的乙醛 酸回补途径(ethylmalonyl-coa pathway , emc 途彳仝)的存在18 19 ,然而在 m. alcaliphilum 20z 中未能检测到emc途径的关键中间代谢物 (如：甲基琥珀酸 (methylsuccinic ac

40、id) 和3-羟 丁酰-coa (3-hydroxybutyryl-coa),该结果表明正常培养条件下，emc途径在m. alcaliphilum20z中没有功能性激活。传统研究认为 edd途径是 rump途径的主 要分支途径同化吸收甲烷氧化产物甲醛，而 emp途径仅是旁支途径5。然而，代谢物组定量 分析却发现了相反结果。由表 1可知，edd途 径的关键中间代谢物6pg和kdpg 浓度很低(其中 6pg 浓度是(150.95 28.75) mol/l, kdpg浓度低于10科mol/4能准确定量)oemp 途径的关键中间代谢物浓度明显高于edd途径的，其中 fbp 浓度是(1 142.02 3

41、02.88) mol/l, gap/dhap 是(1 866.76 388.55) 科 moep 是(3 067.57 898.13) 科mog过比较分析两个分 支代谢途径的中间代谢物浓度，我们可以推测 emp途径很可能在甲烷同化吸收过程中起到更 重要的作用。2.2 edd和em p途径中间代谢物的13c同位 素富集分析由图2可见，在1 min时，果糖-6-磷酸/葡 萄糖-6-磷酸(fructose-6-phosphate/glucose-6- phosphate, f6p/g6p)已经明显获得 1个碳的13c 富集，这表明甲烷快速通过核酮糖 5-磷酸(ru5p) 和甲醛的反应被吸收进入下游代

42、谢途径。 1个碳 标记的f6p/g6p随着时序延长而相对丰度逐渐 减少，而多碳标记的f6p/g6p相对丰度逐渐增加，这是由于磷酸戊糖途径的碳重排反应(图3a)。emp途径下游中间代谢物(如：2-磷酸葡萄糖 /3-磷酸葡萄糖(glucose-2-phosphate/ glucose-3-phosphate, 2pg/3pg)和 pep)也同样 地快速获得1碳、2碳和3碳的13c富集，而且 2pg/3pg和pep在40 min时的总13c富集丰度 分别是54.9%和46.1%,这表明13c代谢流显著 地通过emp途径。由于6pg和kdpg浓度极低， 不能清楚卞测到13c富集。pyruvate是两个

43、分支途径的共同终点代谢 物，如果13c标记甲醛主要通过emp途径同化吸收，将生成 1个碳标记 pyr在第3位(即 3-13c1-pyr),相反通过edd途径将生成1个碳 标记pyr在第1位(即1,13c1-pyr)(图3a)。我 们利用lc-ms/ms 分析1个碳标记 pyr的位置， 发现在13c富集过程中，3-13c1-pyr的丰度高于 1,13c1-pyr的约4-6倍(图3b)。该结果清楚表 明emp途径实际上是更重要分支途径来进行甲 烷的吸收代谢。此外，我们也检测了丝氨酸循环途径的中间代谢物serine和glycine的 c富集规律，serine和 glycine在0- 40 min中1

44、3c富集丰度明显偏低（图2）。2.3 edd和emp途径基因表达水平的比较 分析为了进一步验证代谢物组和13c同位素动态富集研究的结论，我们比较分析了edd和emp途径相关基因的表达水平。由表2可见，在edd途径中，参与催化反应的基因，例如基因 pgi、eda和edd的表达丰度（即rpkm）分别是 263.8、341.2和225.4。反之，emp途径的基因 有明显更高的表达水平，例如基因fbaa、tpia、gap 和 pyka 的 rpkm 分别是 2 479.2、2 493.9、 2 274.6和1 846.0。因此整合转录物丰度、代谢 13物组浓度和 c标记分析的结果，我们认为emp 途径

45、，而不是 edd途径才是 m. alcaliphilum 20z 进行甲烷同化吸收的主要代谢通路（图4）。pyruvatet (mm)f6pmm pm-h)rvi-i-zm+3亲)?=a3一合)3uu曰 punq 4 uije-vht (min)一 一 一十0 0 0 0 0.00 8 6 4 2(gufpunqm u七 hyw; (min)图2 m. alcaliphilum 20z胞内中间代谢物c富集的变化规律fig. 2 13c-incorporation in a time course in m. alcaliphilum 20z. m+0 represents

46、 non-labeled, m+1 representscompound with one c- label, m+2 represents compound with two c-labels, etc. f6p/g6p: fructose-6-phosphate + glucose-6-phosphate; pep: phosphoenolpyruvate; 2pg/3pg: 2-phosphoglycerate + 3-phosphoglycera.ch.1chqh cii2ociiooh* co.oxidationassimilation(kump-pathway)emp-varian

47、toj3 r3。叱-o-ohll2 ?.oh-p-o-c-c-c-ohohhofio )hi ltipon o oh ohhe6pru5pam i_ ,_j i, j.t1 mi lb oh-昨摩二。hn |(kf6pr uj j oh oh 011 66 pgohdapit孝、och.|sil3c|p5-rjvateoji广 li!l.6 gap 6h? ch2 61、厂ii-lil liledilvarianiohon on ohokdpghoc (f p.i3c|prijvatef(niin)(eepunqe 廿二印一口m图3丙酮酸13c示踪分析揭示emp途径和edd途径的甲烷同化代谢能

48、力的差异性fig. 3 pyruvate as an indicator to distinguish between emp pathway and edd pathway. (a)overview of methane oxidation and the ribulose-monophosphate pathway(rump) for formaldehyde assimilation. (b)13c-pyruvate labelingpatterns in a time course.3讨论目前对于甲烷氧化菌研究多涉及于生理、生化特征分析和重构代谢网络，以及甲烷单加氧化酶(methane

49、 monooxygenase enzyme)催化机理与生物修复功能等的研究5。相比参与自然界碳循环的其他微生物系(如：光合作用蓝细菌cyanobacterium prochlorococcus marinus 和甲烷菌methanopyrus kandleri ),甲烷氧化菌基因组研 究起步较晚而后基因组研究几乎是空白 ,基因组和后基因组信息的缺少导致对甲烷氧化菌 代谢工程调控困难和工业化放大限制。近年来methajicpm()cabmejrhanolhfgfadh e-orni aldehydep一h.mtp-c,el 11) nalhatyoxnloacctattmeubolile cor

50、icentrationhigh图4 emp途径是甲烷同化代谢关键通路fig. 4 aschematic model depicting emp pathway is the major route for methane assimilation. the thickness of arrows indicates the level of gene expression. the color of box indicates the concentration of metabolites. ru5p: ribulose-5-phosphate; he6p: hexulose-6-phosp

51、hate; f6p: fructose-6-phosphate; g6p: glucose-6-phosphate; 6pg: 6-phosphogluconate; kdpg: 2-keto-3-deoxy-6-phosphogluconate; gap: glyceraldehyde-3-phosphate; fbp: fructose-1,6-bisphosphate; dhap: dihydroxyacetone-phosphate; pep: phosphoenolpyruvate. gene predicted function: pmocab: particulate metha

52、ne monooxygenase; mxafi: pqq-dependent methanol dehydrogenase; fadh: 2,4-dienoyl-coa reductase; fdsacd: formate dehydrogenase; fdha : formate dehydrogenase;hps:3-hexulosephosphate synthase; hpi: phosphohexuloisomerase; pfk: fructose-2,6-biphosphatase; fba: fructose-bisphosphate aldolase; pykii: pyru

53、vate kinaseii; fdha: tungsten-containing nad-dependent formate dehydrogenase; fdsacd : formate dehydrogenase.表2 m. alcaliphilum 20z的edd和emp途径基因表达水平比较分析table 2 gene expression profile of edd and emp pathways in m. alcaliphilum 20zgenedescriptionreactionrpkm ( x)pfppyrophosphate-fructose 6-phosphate 1

54、-phosphotransferasef6p -g6p924.00fbaafructose-bisphosphate aldolasefbp一fbp2 479.19embden-meyerhtpiatriosephosphate isomerasefbp一dhap+gap2 493.92of-parnasgapglyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenasegappga2 274.64pathwaypgkphosphoglycerate kinasepga3pg488.07pgm32,3-bisphosphoglycerate-independent phosp

55、hoglycerate mutase3pg-2pg278.22enoenolase2pg-pep1 088.27entnerdoudorpgiglucose-6-phosphate isomerasef6p -g6p263.84off pathwayeda2-dehydro-3-deoxy-phosphogluconate aldolasekdpgfpyr341.17edd6-phosphogluconate dehydratase6pg-kdpg225.39mary lidstrom 和 murrell colin 等课题组对 m. alcaliphilum 20z 、 m. trichos

56、porium ob3b 、 methylomicrobium buryatense strain 5g 等不同生 态环境的代表性甲烷氧化菌株进行基因组测序 注释11,21 -22这些前期工作为基因组功能挖掘 和代谢调控机制阐明提供了重要的信息基础。m. alcaliphilum 20z是从盐水湖中分离纯化的中 度嗜盐和耐碱(ph7-11)的甲烷氧化菌。本研究工作整合lc-ms、rna-seq和13c同位素示踪技 术分别从代谢物组和转录物组两个层次系统研究m. alcaliphilum 20z的中心代谢网络。甲烷被 甲烷单加氧化酶氧化生成甲醇，进而氧化成甲 醛，在3-磷酸己糖合成酶(hps)作用下，甲醛和