植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定

1、植物基因转化及转基因植物的分析与鉴定 实验目的 1 了解创建烟草突变体库的方法； 2 理解每种方法的基本原理； 3 掌握农杆菌介导的转基因方法以及转基因产物筛选和鉴定的基本过程。 实验原理 随着越来越多植物的全基因组测序工作的完成， 在此基础上开展功能基因组的研究是目 前的核心研究内容之一。 植物插入突变体库的建立是功能基因组研究的一个重要内容， 在此 基础上也能进行正向遗传学及反向遗传学的研究。 在创制突变体的策略上， 传统方法是使用 物理或化学诱变方法获得， 其优点是可在尽可能短的时间内获得饱和突变体。 与传统的物理 和化学诱变方法相比， 生物诱变 （T-DNA 和转座子插人诱变 ）通常可

2、标记突变基因， 从而较为 容易地分离鉴定靶基因。最近数年，通过农杆菌介导的 T-DNA 插入突变 已成为国际公认的 植物功能基因组学的主要研究方法之一。 烟草是植物基因组研究的一种模式植物， 其突变体库的创建是烟草功能基因组学研究中 的重要内容， 其目的是通过大规模的突变体库平台快速全方位的了解基因组中各个基因的功 能。 突变体的创制是遗传学研究的基础， 也是分离基因和基因功能鉴定的最要途径。 通过诱 导培养，使烟草产生愈伤组织，利用土壤农杆菌感染愈伤组织，实现 T-DNA 标签在烟草愈 伤组织基因组中大量随机插人，利用植物细胞的全能性，经过抗性筛选，诱导分化，从抗性 愈伤组织获得烟草突变体再

3、生植株， 获得各突变体的纯合材料， 从而建立烟草突变体的数据 库，然后分析突变性状与 T-DNA 的共分离关系， 存在共分离的材料用适当的 Tail-PCR 克隆 技术获得 T-DNA 的侧翼基因组序列，用其作探针筛选基因文库，获取目标基因或克隆，再 进行下一步的分析（图实验4-1） 。 T-DNA 载体构建 转化植物（ T1， T-DNA 杂合子 ）收获 T2 种子 筛选T2，获突变子，应为 3:1分离 确定 T-DNA 与突变型共分离的个体 产生纯合后代 克隆 T-DNA 两侧的植物 DNA （Tail PCR） 利用侧翼 DNA 序列作探针从该植物的 cDNA 文库中钓取基因 基因功能的

4、验证（遗传互补测验，分离的野生基因转化突变体，回复功能） 图实验 4-1 T-DNA 标签克隆基因的基本流程 TAIL-PCR 分离法是利用多个嵌套的 T-DNA 插入序列特异性引物（根据 T-DNA 中 靠近右边界处的核苷酸序列设计的引物，Tm值57-62 C和一个短的随机简并引物（ AD , Tm值44-46 C）组合，以突变体基因组DNA为模板，进行多次 PCR反应，采取高温特 异性扩增与低温随机扩增相间进行的方法，最后获得T-DNA 插入侧翼区特异性扩增片 段（实验图 4-2），可作为探针，筛选分离基因。TAIL-PCR 分离法可以降低非侧翼区 特异产物的背景， 同时它可以产生 2 个

5、以上嵌套的目的片段， 与其它方法相比 TAIL-PCR 方法具有简便、特异、高效、快速和灵敏等特点，已经在拟南芥和水稻等植物中获得了 成功及广泛的应用。 实验图 4-2 TAIL-PCR 反应流程图 本实验用含 T-DNA 载体质粒 pCAMBIA1301 的 LBA4404 农杆菌菌株转染烟草愈伤组 织，让T-DNA随机插入烟草的基因组中形成T-DNA突变体，通过PCR特异扩增HPT基因 片段来鉴定转基因烟草， 以 TAIL-PCR 法获得转基因烟草突变体的侧翼基因片段，测序 后将获得侧翼基因片段的序列与 GeneBank 中的已知序列对比， 获得功能基因的全序列。 仪器、材料和试剂 （一）

6、仪器 高速冷冻离心机， PCR 仪，超净工作台，恒温摇床，隔水式恒温培养箱，光照培养箱， 紫外可见分光光度计，凝胶成象仪或Dark Reader,恒温水浴锅，微孔加热器，电泳仪，水 平板电泳槽，天平，酸度计，旋涡混合器。 （二）材料 烟草幼苗，含 T-DNA 载体质粒 pMD83rc 的 LBA4404 农杆菌菌株， Ex-taq DNA 聚合酶， DNA 1kb laddeer ， GoldView 核酸染料。 （三）试剂 1.2 CTAB提取液 100mmol/L Tris-HCl pH8.0 2（ w/v ）CTAB 1.4mol/L NaCl 40mmol/L b- 巯基乙醇 20mm

7、ol/L EDTA 2. TE 缓冲液 10mmol/L Tris-HCl pH8.0 1mmol/L EDTA 3. 50 TA电极缓冲液 1000ml Tris54g 硼酸27.5g 0.5mol/L EDTA20ml 4. 1 0 次氯酸钠 5. 氯仿：异戊醇 （V:V ，24：1） 6. 70乙醇 pH8.0） 7. 溶液 I：50 mmol/L 葡萄糖， 25 mmol/L Tris.HCl （pH8.0），10 mmol/L EDTA 100ml 8. 溶液 III : 60ml 5mol/L 乙酸钾，11.5ml 11.5 %冰乙酸，28.5ml 无菌水 100ml 9. 溶液I

8、I :分别配制 0.4 mol/L NaOH和2% SDS溶液（各30ml），用时1:1混合 10. LB 液体培养基 配制每升培养基，应在 950mL 去离子水中加入: 胰蛋白胨 （bacto-typtone）10g 酵母提取物 （bacto-yeast extract） 5g NaCl10g 摇动容器直至溶质完全溶解，加入200uL 5mol/L NaOH 调节pH至7.0，加入去离子水 至总体积为1升，121C高压灭菌20分钟。 11. MS基本培养基 F .曰.: 人量元糸 mg/L 微量元素 mg/L 有机营养 mg/L NH4NO3 1650 KI 0.83 甘氨酸 2.0 KNO

9、 3 1900 H3B O3 6.2 烟酸 0.5 CaCl2 2H2O 440 MnSO 4 4H2O 22.3 盐酸吡哆醇（ Vb6) 0.5 MgSO4 7H2O 370 ZnSO4 7H2O 8.6 盐酸硫胺素（ Vb1) 0.l KH 2PO4 170 NaMoO 4 2H2O 0.25 肌醇 100 CoCl2 6H2O 0.025 CuSO4 5H2O 0.025 FeSO4 7H2O 27.8 配制方法 母液： 大量元素（50X） 400mL 硝酸铵33g；硝酸钾38g;磷酸二氢钾 3.4g;七水合硫酸镁 7.4g； 铁元素（100X）200mL 七水合硫酸亚铁 0.556g；

10、七水合 EDTA二钠 0.746g； 有机营养（100 X） 200mL Gly 0.040g ； VB1 0.002g ； VB6 0.010g ;肌醇 2g；烟酸 0.010g； 微量元素（1000X） 200mL 碘化钾166mg;硼酸1240mg ; 一水合硫酸锰 3380mg;七水合硫酸锌1720mg ;二水合钼 酸钠 44mg ;五水合硫酸铜 5mg;六水合氯化钴5mg ; 氯化钙（50X） 400mL 氯化钙8.8g 12. 愈伤组织诱导与分化培养基： MS 基本培养基 0.2mg/L 6-BA 0.02mg/L NAA 3% 蔗糖 0.6%琼脂 其中 6-BA 取 25mg 用

11、少量 1M NaOH 溶解后定容到 50mL ； NAA 取 25mg 用少量 1M NaOH 溶解后定容到 50mL ； 2,4-D取50mg用少量1M NaOH溶解后定容到100mL ; 以上激素母液均为 0.5mg/mL 13. 筛选培养基： MS 基本培养基 0.2mg/L 6-BA 0.02mg/L NAA 3%蔗糖 0.6%琼脂 100mg/L 羧苄青霉素 14. 抗生素母液的配制 KANA (50mg/mL) 1g KANA 溶于 20mL 蒸馏水； RIF(50mg/mL )0.25g RIF 溶于少量乙醇再定容至 50mL； STR( 30mg/mL )0.6g STA 溶于

12、 20mL 蒸馏水； 羧苄青霉素( 100mg/mL ) 2g 羧苄青霉素溶于 20mL 蒸馏水。 潮霉素 B( 50mg/mL ) 可以直接购买 实验步骤 I 烟草外植体的无菌培养和诱导再生 1. 烟草叶片预培养： 取烟草完全展开的幼叶，用自来水洗净晾干。在超净工作台中将叶片 浸于70%酒精中30秒，然后移入10%的次氯酸钠溶液中510分钟(消除外植体表面 的微生物)。无菌水至少洗涤 3次(消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗干净) ，每 次停留35min。将无菌叶片剪成 0.5cmX0.5cm大小块或用 6mm打孔器凿成圆盘。 2. 烟草叶片的诱导再生：自行设计 MS 培养基中的 NAA、6

13、-BA 植物激素浓度，诱导烟草 叶片生根或生芽；将上述处理过的无菌叶片接种在含有不同浓度植物激素的MS 固体培 养基中，每周定期观察并更换培养基。 II 转基因烟草的培养 1. 农杆菌的培养：将含 T-DNA 载体的农杆菌单菌落接种到 20ml LB 液体培养基中（ Kana 50ug/ml、RIF、STR）,27C, 180r / min 振摇培养过夜。将 2ml 菌液转入 20ml LB 液 体培养基中，与上述的相同条件培养6小时左右，使菌液达到OD6oo= 0.20.5,用来侵 染烟草叶片 。 2. 烟草叶片预培养： 取烟草完全展开的幼叶，用自来水洗净晾干。在超净工作台中将叶片 浸于 7

14、0酒精中 30秒，然后移入 10的次氯酸钠溶液中 5 1 0分钟（消除外植体表面 的微生物）。无菌水至少洗涤 3 次（消毒液对外植体有很大伤害，必须清洗干净），每 次停留35min。将无菌叶片剪成 0.5cmX0.5cm大小块或用 6mm打孔器凿成圆盘。 3愈伤组织转化：在80r/min摇床上旋转浸染510分钟。将叶外植体置于无菌滤纸上吸去 多余的菌液（如果叶片粘附细菌过多，可以在无菌水中漂洗12次）。 4. 共培养：将侵染过菌液的叶片接种在MS愈伤组织诱导和分化培养基上，在26C黑暗条 件下共培养 3 天。 5. 筛选培养与分化： 将共培养处理的烟草叶片转移到凝固后的筛选培养基上 （100u

15、g/L 羧苄 青霉素和50ug/L潮霉素B,羧苄青霉素起到抑制农杆菌生长的作用。如果农杆菌生长未 被抑制，农杆菌将抑制叶外植体的生长）。每隔 3 4 天继代一次，培养条件为，光照 2000lx，温度26C,日照16h。4周后转基因细胞分裂生长形成大量愈伤组织并有根、 芽分化。接种烟草叶片于无激素的 MS 培养基上培养，培养条件同上，同时作为对照实 验（无愈伤组织生长和器官分化）。 皿转基因烟草的检测 1. 剪取培养后的转化烟草和前期实验未转基因烟草叶片小片，液氮中研磨至粉末状，加入 0.5mL65 C预热CATB抽提液65C水浴抽提30min，间歇混匀； 2. 取上清各加入 0.5mL 氯仿异

16、戊醇（体积比 24:1）去除蛋白， 12000rpm 离心 10min； 3. 取上清加入1体积预冷异丙醇至-20C出沉淀3060min , 8000rpm离心15min ; 4. 弃上清， 70%乙醇洗涤 2 次干燥，避光保存； 5. 加入15 蒸馏水溶解并电泳检测（0.7%琼脂糖凝胶电泳）； 6. 提取 pMDC83rc 质粒： (1) 3-5ml过夜菌12000rpm离心1min，弃上清; (2) 力口 300 L预冷溶液I，颠倒混匀6-8次； (3) 加300卩新鲜不预冷溶液II，颠倒混匀6-8次； (4) 加3001预冷溶液III，颠倒混匀6-8次； (5) 12000 rpm 15

17、min，转移上清液; (6) 加入0.5倍体积的异丙醇，混匀，室温放置3min，如上离心12min ; (7 )弃上清，70%乙醇洗沉淀； (8)空气干燥，20ml蒸馏水溶解，-20C贮存。 7. 对提出的基因组 DNA进行PCR扩增； 引物和扩增体系同上述的PCR步骤； GFP引物 GFP-F: 5 GCGGCGATGAGTAAAGGAGAAGAAC- 3, GFP-R: 5 -TTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTTG- 3 (1 )在0.2mlPCR管中，按照下表配制 PCR反应体系(25讥)。 无菌水 10 XPCR Buffer dNTP Mixture GFP-F GFP-R Ex-Taq 模板 DNA 14.2 ul 2.5 (iL 1 (iL 0.5 (iL 0.5 (iL 0.3 (iL 1 ul (2)按如下程序对转