响应面法优化重组毕赤酵母菌表达β-甘露聚糖酶的诱导条件

1、安徽农业科学，JournalofAnhuiA Sei2014，42(11)：31533155，3198责任编辑 石金友 责任校对 况玲玲响应面法优化重组毕赤酵母菌表达 D-甘露聚糖酶的诱导条件李慧玲 ，刘祖艳 ，赵敏(1东北林业大学生命科学学院，黑龙江哈尔滨 150040；2黑龙江中医药大学药学院，黑龙江哈尔滨 150040)摘要 目的对重组毕赤酵母茵表达 B一甘露聚糖酶的诱导条件进行优化。方法以重组毕赤酵母 GS115为研究对象，通过单因素试验确定最佳产酶条件，并采用响应面试验确定 3个因素的最佳水平。结果最佳产酶条件为：培养温度 28，培养 pH 65，摇床转速210rmin，培养基装液量

2、100ml。响应面试验确定3个因素即装液量、甲醇添加量和 pH最佳值分别为10318ml、177和669；在此条件下，p一甘露聚糖酶的活力最大值为49175 Uml。结论验证试验证明模型预测值准确、可靠，为重组毕赤酵母菌的合理开发利用提供了依据。关键词 重组毕赤酵母；3-甘露聚糖酶；响应面中图分类号 S182文献标识码 A文章编号 05176611(2014)110315303Optimization ofExpression Conditionsof mflnnflnflse Induced by RecombinantPcha pastorsby Response Surface Meth

3、odologyLIHui-ling，ZHANG Manetal (ColegeofLifeSciences，NortheastForestryUniversity，Harbin，Heilongjiang150040；ColegeofPharma cy，HeilongjiangUniversityofChineseMedicine，Harbin，Heilongjiang150040)Abstract ObjectiveTooptimize theinduction conditionsoftherecombinantPichiapastoris-mannanaseMethodWithrecomb

4、inantP iapastorisGS115 asstudyobjecttheoptimalenzymeproducingconditionsandhreetfactorsoptimal levelweredeterminedbysinglefactorexperimentandresponsesurfaceexperimentrespectivelyResultTheoptimum enzymeproducingconditionsrea：temperature28，pH 65，rotatingspeed210rmin，volumeofmedium 100m1Responsesurfacem

5、ethodologywasusedtooptimizetheabovehreetfactors(volumeofme dium，methanolconcentration，pH ofmedium)withtheoptimum value10318ml，177，669，respectivelyheTBmannanaseactivitywouldreachthehighestvalue(49175Um1)underhetoptimizedfermentationconditionsConclusionThepredictedvaluesfrom theresponsesurface methodo

6、logy wereproved tobecorrectand reliableby verificationtest，which wilprovidea referenceforappropfiateutilization and develop mentofrecomb inantPichia pastorisKey words RecombinantPichia pastoris；Bmannanase；Response surfacemethodologyp一1，4一D一甘露聚糖酶 (p一1，4一Dmannan mannanohydro-lase，EC32178)，简称为 p甘露聚糖酶(p

7、mannanase)属于半纤维素酶类，可以断裂 B一1，4-D-甘露糖苷键 。 一甘露聚糖酶广泛应用于纸浆、饲料和钻井等生产领域 J。B-甘露聚糖酶存在于细菌、酵母菌、丝状真菌和植物中 J。来 自于细菌的 B甘露聚糖酶已被分离得到，如 Baeillus subtilis WY34、Cellulosimicrobium spstrain HY一13、Sphingomonasstrain等 。克隆细菌的 B-甘露聚糖酶并且高效异源表达有助于满足工业生产的需求。甲醇营养型毕赤酵母成功作为高水平表达异源蛋白的表达系统 “。笔者为了使构建的重组毕赤酵母表达 B甘露聚糖酶潜力充分发挥出来，优化其发酵过程，

8、以获得较高的产物浓度。研究选用装液量、甲醇添加量和 pH值 3个关键因素为 自变量，以重组 B-甘露聚糖酶的酶活力为响应值，利用响应面法(responsesurfacemethodology，RSM)进行发酵条件优化并确定最佳方案，以期为重组毕赤酵母的进一步开发利用提供依据。1 材料与方法11 材料111 供试菌株。分泌表达 B一甘露聚糖酶的重组毕赤酵母菌 Manl2，由东北林业大学微生物与免疫实验室保存。112 主要试剂。培养基的配制方法参见 Invitrogen公司毕赤酵母操作手册。作者简介 李慧玲 (1979一 )，女，黑龙江北安人，讲师，硕士，从事环境微生物和生物药物研究。收稿 13期

9、 2014-03-0412 方法121 菌株的诱导表达。取一80冰箱保存的甘油菌接种于 YPD培养基中，划线活化，28倒置培养。挑取菌株接种至 BMGY培养基中培养 1618h至 DD =26，离心收集菌体，用 BMMY重悬菌体，使 0D =10左右；取菌液继续震荡培养，每隔 24 h加入无水 甲醇诱导，诱导 72h，测定酶活性。122 粗酶液的制备。取诱导表达 Man12菌株培养液，离心后上清液即为粗酶液。123 重组 B-甘露聚糖酶活力测定方法。采用改进的 3，5一二硝基水杨酸法(DNS方法)测定酶活力 ，利用比色法测定酶解后还原产物的生成量，以表示酶的活力。酶活力定义：在一定温度和 pH

10、下，以每分钟生成相当于 1ixmolD一甘露糖所需酶量为一个酶活力单位(Iu)。124 培养温度对重组毕赤酵母产酶的影响。重组毕赤酵母菌分别在 24、26、28、30和32条件下培养，以确定最佳培养温度。 125 甲醇浓度对重组毕赤酵母产酶的影响。在 BMGY培养基中分别添加浓度为 025、050、100、150、200和 250的甲醇，诱导培养 72h后测定酶的活力，以确定甲醇的最佳添加量。126 不同 pH值对重组毕赤酵母产酶的影响。通过添加01molL的磷酸钾缓冲液使培养基的 pH值分别达到 30、40、50、60、70和 80的培养基，经甲醇诱导表达 72 h后测定酶的活力，以获得发酵

11、培养最佳 pH值。127 摇床转速对重组毕赤酵母产酶的影响。重组毕赤酵3154安徽农业科学母菌摇床培养时转速分别设定为 180、190、200、210、220和230rainr，进行培养。128 培养基装液量对重组毕赤酵母产酶的影响。分别将50、70、100、110、120和 130ml经 BMMY重悬的菌液装入 500 rnl三角瓶中培养，测定酶活，获得最佳装液量。129 响应面优化发酵条件。利用 Design。Expert软件进行装液量、甲醇添加量和培养基 pH3个条件的响应面分析，以B一甘露聚糖酶酶活力为响应值。2 结果与分析21 培养温度对重组毕赤酵母产的影响 图 1表明，培养温度在

12、28和 30时酶活达到最大值 ，32时酶活有所下降，毕赤酵母菌生长在最适温度的时候，生长旺盛，产酶量增加，酶活达到最大值。5 0004 000寒 3 000髓罄 200543，11 000咖咖0O2426283O32培养温度 图 1 培养温度对重组毕赤酵母产酶的影响5 0004 0003 000鎏201 0000n 25旺5115225甲醇添加量 图2 甲醇添加量对重组毕赤酵母产酶的影晌适的pH也可以减少 p一甘露聚糖酶在发酵过程中的消耗。图 3表明，当培养基 pH值是 65的时候酶活达到最高。墨誊455O5506570培养基pH值图 3 培养基 pH值对重组毕赤酵母产酶的影响4 0003 0

13、00毒201 000O1801902002l0220230转速 rmin图 4 摇床转速对重组毕赤酵母产酶的影响24 摇床转速对重组毕赤酵母产酶的影响 由于重组毕赤酵母生长过程耗氧量大，当摇床速度增加时，培养基中的溶解氧含量上升，有利于其生长。图4表明，当摇床增加转速达到 210rmin时，重组 B一甘露聚糖酶活性最大。但是当转速进一步提高后重组酶的活性提高不大。25 培养基装液量对重组毕赤酵母产酶的影响 图 5表明，在 500ml三角瓶中装入 100120 ml培养基时，产 B一甘露聚糖酶活性最高。培养基的装瓶量影响着培养基中的溶氧量，当培养基所占体积过多时，摇瓶中的空气含量减少，导致培养基

14、中的溶氧量降低，影响重组毕赤酵母的生长。54咖22 甲醇浓度对重组毕赤酵母产酶的影响 毕赤酵母是甲醇利用型酵母，能以甲醇为唯一的碳源进行生长。由于外源基因是整合到 AOX1下游的，因此重组毕赤酵母外源基因的墨表达受甲醇的严格调控。图 2表明，当甲醇浓度在 15时 ，鎏重组 B一甘露聚糖酶活性达到最大值。在重组毕赤酵母诱导表达外源蛋白过程中：当甲醇浓度过低时，重组毕赤酵母因缺乏碳源生长受到抑制，当甲醇含量过高时，由于甲醇会导5O7O10O110120130致细胞中毒，也可使重组毕办酵母表达外源基因受到影响，装液量mL适宜的甲醇含量可使重组毕赤酵母高效表达外源基因 。23 不同 pH值对重组毕赤酵

15、母产酶的影响 重组毕赤酵图 5装液量对重组毕赤酵母产酶的影响母生产 B一甘露聚糖酶的过程涉及多种酶促反应 ，在某一 pH26 响应面优化试验结果筛选培养基的装液量、甲醇添值条件下 B一甘露聚糖酶会被毕赤酵母生长过程 中释放的蛋加量和培养基 pH进行响应面试验，以粗酶液的 B一甘露聚糖酶活力为响应值。A代表装液量，B代表甲醇用量，c代表溶白酶所降解，因此必须添加合适 pH的缓冲溶液以稳定酵母液 pH值。采用 DesignExpert软件建立回归模型为 y(p-甘生长环境的 pH，以此来提高 p一甘露聚糖酶的产量。同时合3198安徽农业科学2014盎是含尿素培养基，远远低于对照，原因与碳源试验相同

16、，可能是菌丝死亡了一部分，所以产量较低。因此，从多糖产量上分析，最佳氮源为黄豆粉，尿素不应作为氮源加以使用。1201OO凿争婀苷 80婚苹2。0甏誊蕾饕集注：数据来源于 4个重复的平均值。无相同小写字母表不差异显著。图 7 不同氮源培养基中菌丝体多糖含量3 结论该研究以人工栽培的花脸香蘑分离获得的菌株为研究对象，采用液体培养的方法，对菌丝体进行碳源和氮源利用能力试验，通过比较分析菌丝体麦角固醇含量和多糖含量，研究不同碳源和氮源对菌丝体生长和多糖含量的影响。通过比较分析麦角固醇含量结果显示，果糖、甘露糖、纤维二糖、蔗糖、葡萄糖和麦芽糖都可以作为花脸香蘑菌丝体生长的碳源，但相比之下，果糖、甘露糖和

17、纤维二糖是更为理想的碳源，而选择果糖作为碳源，多糖含量则最高。丙氨酸、甘氨酸、黄豆粉和蛋白胨都可以作为氮源使用，添加丙氨酸的培养基中，菌丝生长效果最好，而含有黄豆粉的培养基中，则是多糖含量最高。不论是比较菌丝体生物量，还是分析多糖含量，其结果都显示，在液体培养条件下，不应该选择尿素作为氮源。(上接第 3155页)蛋白的培养条件有一定差别，需要后期优化其发酵条件，以获得更多的表达产物。3 结论试验利用响应面分析方法优化重组酵母菌摇瓶培养条件，最终获得产酶最优条件为：培养温度为 28，摇床转速是 210rmin，装液量是 10318ml(500ml三角瓶)、甲醇加入量为 177 、pH是 669，

18、为重组毕赤酵母的中试发酵生产奠定基础。参考文献1MCCLEARY B VBInalfnanaseJMethodsin Enzymology，1988，160：5966102SCHOMBUGD，SALZMANN MEnzymeHandbokMBerlin：Springer-Verlay Berlin Heideberg，1991，1-53BENECH RO，H X，PATROND，et1aRecombinantexpression，character-ization，nda pulp pr ebleaching propey ofa Phanerochaete chrysosporiumendo

19、B-1，4一inannanaseJEnzymenda Microbial Technology，2OO7，41：7407474WU G，BRYANT M M，VOITIE R A，eta1Efectsof13-annanasemin cornsoydietson commercialleghomsinsecond-cyclehensJPoultryScience，2005，84：894897参考文献1卯晓岚中国大型真菌M郑州：河南科学技术出版社，20O0：1802李挺，宋斌，林群英，等我国香蘑属真菌研究进展J安徽农业科学，2011，39(13)：7579-7581，777O3胡先运，李香莉，张

20、勇民，等花脸香蘑菌丝体氨基酸分析 J氨基酸和生物资源，21706，29(1，：51524罗心毅，洪江，张勇民人工栽培花脸香蘑氨基酸研究J氨基酸和生物资源，2oo3，25(3)：l4155胡先运，江家志，罗心毅花睑香蘑子实体蛋白质营养评价J氨基酸和生物资源，0ll2，33(44)：55576卢成英，钟以举，饶立群三种野生菇驯化后子实体营养成分分析J吉首大学学报，1993，14(6)：38417罗心毅，洪江，张勇民花脸香蘑元素测定J中国食用菌，2003，2(4)：4348MZUR X，BECKER U，ANKE T，et1aTwonew bioactivediterpenefrom Lepista

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