土牛膝中齐墩果酸牛膝多糖的提取与鉴定

1、土牛膝中齐墩果酸牛膝多糖的提取与鉴定Extracting and Identification of OA and ABPS of local achyranthes asperaHUANG Zhi-fang,HUANG Zhi-hong, HU Ji-lin,et al.Department of Chemistry and Life Science, Xiangnan University, Chenzhou 423000,China【】 Objective To extract oleanolic acid(OA) and achyranthes bidentata polysaccha

2、rides(ABPS) from local achyranthes aspera, and analyze quantitatively and qualitatively. Methods The oleanolic acid(OA) was obtained from the decoction of local achyranthes aspera through the process of washing, acid hydrolysising, adding alkali and boili ng; etha nol reflux ing, vacuum filtrati ng

3、and 60Cdrying. After the ethanol hot refluxing and aqueous extracting, the achyranthes bidentata polysaccharides (ABPS) are obtainedthrough the process of condensing, sedimenting, impurities removing, vacuum filtrating, washing, cooling and drying. Ultraviolet spectroscopy and TCL are adopted for qu

4、alitative and quantitive analysis.Results The extracting rate of OA and ABPS were 0.88% and 7.2% respectively. Conclusion The experimental method of comparising the content determination and the extracting rate is easy and feasible.土牛膝, 别名倒扣草 ,中国药典汇编对土牛膝有如下记载 : 药性 :苦、凉。归肺、脾、肝、膀胱经。药效 : 败毒抗癌、逐淤 除痹,消炎利

5、尿。现代医学研究证明 , 土牛膝具有改善机体微循环 调整新陈代谢 , 改善免疫功能等作用。 具有明显的抗炎抗菌作用、 镇痛作用、抗衰老等 1-3 作用。近年来有研究表明与牛膝含有 成分的齐墩果酸、 牛膝多糖具有治疗糖尿病的功效 4-6, 但土牛 膝提取物在治疗糖尿病方面的研究尚无报道。以本地野生土牛膝为原料经过提取、分离、过 滤、干燥得到土牛膝提取物齐墩果酸、牛膝多糖, 将对土牛膝提取物治疗糖尿病的研究具有重要意义。1 材料1.1 土牛膝 湖南郴州郊外野生自己采集、洗净、除去残留 芦头、切段、晒干。1.2 试剂和仪器 齐墩果酸标准品 ,优级纯 ,什邡市巨邦植物 原料XX公司；葡萄糖,其余试剂均

6、为市售分析纯。电子天平,上海 精密仪器仪表XX公司；低压型抽虑装置，唐山市玻璃仪器厂；722 型分光光度计，上海天翔光学仪器 XX公司；硅胶板:512 cm北 京市昌平石鹰化工厂。2 方法与结果2. 省略2.1.1 土牛膝水煮提取液 取土牛膝 150 g, 制成细块状药材,105 C烘干3 h,取出加10 g碳酸钙细粉和6倍量的蒸馏水， 置于 1000 ml 大烧杯中加热煮沸 3 次:每次煮沸 2 h 后过滤得到 滤液和滤渣 , 滤液贮存待用 , 滤渣用同法煮沸 3 次, 将 3 次滤液合 并, 放置 5 h 后析出沉淀 , 取上层清液约 200 ml 。2.1.2 齐墩果酸的粗提 将上清液置

7、于 500 ml 烧杯中 , 加 5%Hcl 50 ml混匀,60 C左右水浴加热水解约 5 h,水解完毕后溶液 有褐色沉淀产生，趁热过滤，水洗滤饼后，滤饼用3%NaO溶液煮 沸后即时过滤得到滤饼 , 滤饼用水煮沸一次 , 沸腾后即时过滤 , 得 到钠盐粗品。2.1.3 齐墩果酸的精制 将粗品加 1%活性炭和 10倍量的 95% 乙醇回流热熔1 h趁热过滤，滤液放冷后以稀HCL调PH在1到2 之间,放置 24 h, 使结晶充分 ,抽滤干后 ,以蒸馏水洗至近中性,60 C烘干，得齐墩果酸精品1.32 g。2.1.4 齐墩果酸提取率 提取率=1.32 g/15 0 g X ?=0.88%。2.1.

8、5 齐墩果酸提取品的鉴定 8 性状: 呈白色针状结晶与 标准品相同。 Liebermann-burchard 反应: 两液面交界处出现红 紫色环,为阳性反应。薄层层析及显色 :如图 1 所示,标准品齐墩 果酸斑点显紫红色微泛蓝黑色，测定RF值为9.5 cm。供试品在 标准品齐墩果酸出现斑点的平行位置处出现斑点 ,斑点显紫红色 微泛蓝黑色，测定RF值为9.4 cm,约为9.5 cm,可以确认供试品 的主要成分一样都是齐墩果酸。2.2 土牛膝中齐墩果酸的含量测定 92.2.1 供试品溶液的制备 精密称取土牛膝的粗粉 0.8 g, 加 50%乙醇-浓硫酸9:1试液20 ml于85C水浴中回流提取 2

9、 h过 滤,洗涤,合并滤液,置水浴上挥发去溶剂 ,残留物用甲醇溶解 ,置 过滤 , 然后定容 10 ml, 即得供试品液。图 1 齐墩果酸的薄层色谱图图2牛膝多糖水解产物和果糖的TLC图2.2.2 标准曲线的绘制 精密称取齐墩果酸对照品 25.52 mg, 置于 25 ml 量瓶中 ,用氯仿稀释至刻度。 取此对照品溶液 10、20、 30、40、50卩I于试管中，加5%香草醛-冰醋酸溶液0.20 ml,高 氯酸0.8 ml于60C水浴上加热10 min。取出，立即用冷水冷却， 然后加冰醋酸 5.00 ml 稀释,摇匀后于 722型分光光度计 550nm 波长处测定溶液的吸收度 A。由吸收度和相

10、应齐墩果酸对照品量 求得回归方程为：A=0.0072B-0.0068,r=1。2.2.3 含量测定 精密吸取供试品溶液0.05 ml, 用对照品相同的方法测得吸收度 A=0.2233, 通过计算得 齐墩果酸的含量为 0.799%。2.3 土牛膝中牛膝多糖的提取 102.3.1乙醇回流提取土牛膝粗粉50 g,用75%乙醇回流提取 回收乙醇 ,得到药渣,干燥后水提 ,再浓缩水提液 ,加95%乙醇充分 沉淀,过滤后将沉淀再次水溶解 ,加入三氯乙酸去除蛋白 ,取上清 液。上清液加 95%乙醇沉淀 , 得到的沉淀物经过抽滤后并经无水 乙醇、丙酮、乙醚相继洗涤后低温干燥得牛膝多糖产品 3.6 g 。 牛膝

11、多糖的提取率为 :3.6 g/50 g=7.2% 。2.3.2 牛膝多糖提取品的鉴定 性状:呈红褐色粉末状。 牛膝 多糖水解后会得到葡萄糖和果糖 , 并且葡萄糖 : 果糖=1:8 。只要鉴 定土牛膝多糖的水解产物中含有葡萄糖和果糖 , 就可证明样品是 土牛膝多糖。照薄层色谱法 （中国药典 2000年版二部附录 V B） 试验,薄层层析及显色 :如图 2所示,果糖标准品的薄层色谱图上 的主斑点与提取物水解产物的薄层色谱图上的主斑点在相同位 置上出现，其RF值相同。斑点的颜色深浅一致，说明该提取物水 解产物中含有果糖。做斐林反应有砖红色沉淀产生 , 说明该提取 物水解产物中含有葡萄糖。 由此可以证

12、明本实验的提取品是牛膝 多糖。2.4 土牛膝中多糖的含量测定 11:2.4.1 供试品溶液的制备 精密称取土牛膝细粉 1.000 g 。加95 %乙醇100 ml,60 C回流提取3 h后过滤醇提药液得到药 渣，将药渣干燥。药渣加水50 ml回流提取2 h,过滤得到滤液， 提取 3 次, 合并 3 次滤液约 80 ml 用 500 ml 洁净烧杯贮存。然后 浓缩至25 ml,加95%乙醇至含醇量85%,放置24 h使其充分沉淀， 抽滤溶液得到残渣 ,残渣用 75 %乙醇洗涤,残渣自然干燥 ,于100 ml 容量瓶定容。精密吸取 1 ml 置 50 ml 量瓶中定容 , 即得供试 品溶液。2.4.2 标准曲线的绘制 精密称取葡萄糖 0.002 g, 置50 ml 容量瓶中，用水溶解定容,即得葡萄糖对照品溶液 45卩g/ml。 精密吸取对照品溶液 0.0,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2 ml 于刻度试管 中, 加蒸馏水至 2.0 ml, 加 5%苯酚溶液 1 ml, 混匀, 迅速加入 5 ml 浓硫酸 , 振摇 5 min, 置沸水浴中 15 min, 再置冷水浴中冷却 30 min, 在分光光度计上 485 nm 处测定吸收度。得回归方程 : A=0.01B-0.0608,R=1 。243含量测定 精密吸取供试品溶液25卩I,用对照品