基因治疗用腺病毒载体研究进展

1、基因治疗用腺病毒载体研究进展录入： wei 来源： Internet 时间： 2008-9-20 【 字体：大 中 小 】 双击滚屏 【摘要】 近十年来 , 腺病毒载体已经成为了基因治疗的有效载体 , 各种重组腺 病毒在抗肿瘤和治疗遗传病等方面发挥了重要作用。本文介绍了腺病毒载体系 统的特点 , 腺病毒的感染动力学及包装细胞代谢的变化和定量计数方法 , 腺病 毒生产和纯化方法及其产品的质量控制 , 对腺病毒生产的发展趋势和存在问题 进行了阐述。【关键词】 基因治疗 腺病毒载体 生产方法 【本页关键词】省级期刊征稿 硕士毕业论文写作 【正文】基因治疗指的是把功能基因导入病人体内使之表达 , 并因

2、表达产物 蛋白质发挥了功能而使疾病得以治疗。 人类疾病的发生都是人体细胞本身的基因 改变或由外源病原体的基因及产物与人体相互作用的结果。 长期以来科学家们思 考人类是否能依靠人本身的或是外源的遗传物质来治疗疾病 , 这就是基因治疗 的含义。从上世纪九十年代开始 , 腺病毒就作为了基因治疗的有效载体 , 已经报 道的 1000 多种基因治疗的临床方案中 , 约 26% 是用腺病毒作为载体。 腺病毒载 体可以在包装细胞内高滴度复制 , 是上呼吸道自然存在的温和病毒 , 可以感染 多种分裂期和非分裂期的细胞。 第一代腺病毒载体构建的目的是为了治疗几种单 基因疾病 , 这种病毒载体通常删除了 E1 和

3、 E3 区以便插入目的基因 1 , 而且 要全身重复给药才能将目的基因转入靶细胞内。 第二代腺病毒是复制缺陷型病毒 人们进一步删除了 E2a, E2b或E4,降低了免疫原性及RCA的出现。人们又构 建了第三代腺病毒载体 , 也叫假病毒或辅助依赖性腺病毒 2- 4 。1 、腺病毒的感染动力学及包装细胞代谢的变化删除 E1 和 E3 区的腺病毒基因组长约 36kb, 其容纳外源基因的的长度 在78kb。腺病毒感染包装细胞的过程可以分为三步：一是扩散和吸附，病毒 扩散并吸附在细胞表面。 二是结合并扩散入细胞核 , 这一阶段通常通过细胞的内 吞作用来完成。三是基因转录及 DNA复制。在动物细胞的大规模

4、培养中，限制 细胞生长的因素很多 , 包括所需营养的缺乏、 代谢副产物的抑制、 传氧速率的限 制、pH的变化和剪切力的损伤等5 ,其中营养物质对细胞的影响尤为重要。在培养基中葡萄糖是主要的碳源和能源物质 , 谷氨酞胺则是主要的氮源和能源 物质, 它们在动物细胞的生长、 繁殖和代谢产物形成过程中起着重要作用。 葡萄 糖是主要的碳源和能源物质 , 经细胞内的代谢过程 , 绝大部分生成乳酸释放到 培养液中6 ,同时提供能量(A TP)和还原力(NADH),少部分通过磷酸戊糖途径生成核酸的前体一核糖 , 仅有极少部分进入 TCA 循环7, 8 , 并且直接 参与了谷氨酞胺的代谢过程。2、腺病毒的定量和

5、计数方法 在研发新生产工艺的早期阶段容易忽视的一个重要问题就是腺病毒的定量 定量问题在腺病毒基因治疗的最终临床应用中更为重要。 现在生产企业和学术研 究人员已经充分认识到了腺病毒定量的重要性。 为了不同实验室间数据能进行相 互比较 , 美国成立了一个腺病毒参考物质工作组 , 目的是建立腺病毒的参考标准 品。世界上所有的研究和开发机构都可以获得此标准 , 以便对腺病毒的定量方法 进行标准化以及方便对临床前和临床资料的解释。 人们建立了阴离子交换的高压 液相方法定量检测腺病毒颗粒 , 该方法的可重复性和准确性较紫外分光光度计 法显著提高9 。其它的方法还有荧光标记病毒 DNA以及测定病毒六邻体蛋白

6、 的方法等。有趣的是人们注意到 V ellekamp 等10 近来报道了关于观察不同 色谱柱纯化的腺病毒批次间病毒空壳的差异情况。3 、腺病毒的生产方法 腺病毒生产方法根据包装细胞不同而分为贴壁细胞培养与悬浮细胞培养。主要用于 E1 区缺失腺病毒生产的包装细胞为起源于人胚肾的 293 细胞, 此 细胞包含有腺病毒缺失的 E1 区。许多悬浮和无血清驯化的细胞克隆在各个实验 室可以获得 , 293细胞的相关生物学特性现在已经被详细阐明 , 而且正在用于符 合 GM P 标准的工业化生产中。免费获得该细胞系以及生产的病毒滴度高是293细胞的主要优点。 对于商业化生产而言 , 悬浮细胞系比较适应大规模

7、生产 , 而且 悬浮培养的细胞一般可以在无血清培养体系中培养 , 不添加任何其它动物来源 的添加剂 , 这样就有利于分离纯化。 灌注培养是对流加模式改进后的一种培养方 法, 通过不断更换新鲜培基 , 同时应用细胞截留装置使细胞保留于生物反应器内 可以顺利实现培基的原位交换。 一些作者建议用灌注培养的方法获得高密度的细 胞, 然后将细胞转移到其它生物反应器中生产腺病毒。 灌注培养模式已经得到了 广泛的认可和接受 , 并且成为腺病毒大量生产最常用的培养模式。4 、腺病毒的纯化方法重组腺病毒的纯化是大规模生产中的关键问题 , 最经典的纯化方法是两 步氯化铯密度梯度超速离心法 , 此方法是生产小量临床

8、级产品的有效方法。 但这 一工艺放大困难 , 需要建立适用于大规模生产的纯化技术。 人们不断地努力研发 可用于大规模生产的腺病毒分离纯化工艺 , 如离子交换、疏水性相互作用、 金属 鳌合和凝胶过滤等 11, 12 。近年来阴离子交换树脂已经逐渐成为主要分离纯 化手段, 得到了较好的结果。经常使用的阴离子交换树脂主要有 Q Sepharo se XL、Source 15Q 以及 DEA E 等, 回收率均能达到 65% 以上, 分离效果也较好。 Green 等 13 提出离子交换层析后使用聚四氟乙烯树脂层析法除去第一步离子 交换未除尽的宿主和病毒蛋白 , 还有学者提出采用离子交换和凝胶过滤相联合

9、 的方法进行纯化 , A rcand 等14 提出先进行 F ractogelEMD DEA E - 650 离 子交换层析 , 而后进行 Sephacryl S -400HR 凝胶过滤的纯化方法。最近有文献 报道15, 16 ,利用阳离子去垢剂沉淀宿主 DNA方法来分离纯化腺病毒,他们的方法是首先在细胞裂解液中加入氯化十六烷基嘧啶或溴化度灭芬等阳离子 去垢剂进行充分搅拌混合，此时宿主DNA就会被沉淀，随后经过两次超滤去除 DNA沉淀,最后再经过Source 15Q分离纯化,他们报道最后腺病毒的回收率均 大于 50%。这种方法的最大优点是费用低廉 , 容易进行放大 , 非常适合商业化生 产。5

10、 、腺病毒产品的质量控制生产过程中复制完全型腺病毒的测定非常关键 , 通常是用 74 科技 信息高校理科研究敏感细胞的细胞致死效应来测定 , 但是这种方法周期长，现在更灵敏的方法是PCR. RCA的出现促使人们去寻找更可靠的包装 细胞株。对重组腺病毒的质量控制贯穿于整个生产纯化过程 , 包括包装细胞、 病 毒、粗分离产品、纯化产品和最终产品。 Roetsch 等人17, 18 从稳定性、有 效性和纯度三个方面详细报道了基因治疗中重组腺病毒的质量控制手段。 稳定性 包括病毒基因组的稳定性和治疗基因表达的稳定性 , 前者的检测用酶切、 电泳和 Southern blo t 等方法。有效性包括总病毒

11、颗粒数与病毒滴度之间的比例和具 有感染效力的病毒颗粒中治疗基因有效表达的比例 , 在临床治疗中病人接受的 剂量用病毒总颗粒数表示。 所以上述两种比例就显得尤为重要。 纯度包括野生型 RCA的检测、杂蛋白污染检测，RCA s的检测用生物法和PCR法,杂蛋白污染 的检测用反相HPLC和MALD I- TO F质谱联用法。6 、腺病毒生产的发展趋势与存在问题在过去几年中 , 新的腺病毒载体不断研制成功 , 对腺病毒载体的大规模 生产工艺提出了迫切的要求 , 人们尝试了各种方法 , 通过腺病毒载体生产工艺的 改进, 使得重组腺病毒的大规模生产成为可能。 包装细胞的培养工艺逐渐转向无 血清悬浮灌注培养方

12、式 , 以增加细胞密度 , 提高病毒产量。 由于目前大量的研究 主要集中在包装细胞的培养工艺和腺病毒的纯化和计数方法 , 病毒在宿主细胞中 的DNA复制和成熟的机制知之甚少，最终提高病毒的产率和滴度以及完善流加 和灌注工艺还有赖于对病毒复制与成熟机制的了解。 在整个重组腺病毒的生产纯 化工艺中 , 纯化和计数是比较薄弱的环节 , 虽然目前探索了不少的纯化计数方法 , 但是其中所用到的设备和材料价格昂贵 , 所以还有待进一步开发适合大规模纯 化要求的设备和材料 , 或者成本低廉的纯化工艺。 质量控制是生产中非常重要的 一环, 它应该包括两方面的内容 : 首先, 它不仅是对最终产品质量的把关 ,

13、还 应该贯穿在整个生产过程中 ; 其次, 国内和国外目前对于应用在临床的重组腺 病毒载体的质量标准还很不完善 , 所以在质量标准的制定方面应加大研究力度 , 从而提高产品的治疗效果 , 减少副作用的发生。参考文献 1 Danth inne X, Imperiale MJ. P roduct ion of firstgenerat ion adenovirus vecto rs: a review. Gene Ther, 2000. 7:1707- 1714. 2 L uskyM , Ch ristM , R it tner K, et al. In vit ro and in vivobio

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