细胞支原体污染一般情况及预防措施

1、百度文库让每个人平等地捉升口我细胞支原体污染一般情况及预防措施细胞株若受到细菌、真菌、支原体、或是特定病毒等之污染时，会严重的影响实验的结果。而细菌、真菌 等之微生物污染时.较易自培养基等的外观变化察觉。但是若受到支惊体之污染时.细胞之外观较无明显 变化.但是其污染会造成细胞之生长速率缓慢.细胞产生病变之型态改变等等变化。各国细胞库支原体污染的统讣表.如下：国家受支原体污染（）报告年度USA-FDA 15 1993（past 30 years）USA-ATCC 15-20 1992Japan-（IFO, RIKEN, JCR 80-30-22 1981Germany-DSM 36 1990-1

2、994Argentina 65 1987Israel 32 1986-1993China 95 1990造成支原体高污染率的原因为：仁支原体size um,无细胞壁.可透过一般过滤膜（urn）2支原体污染时，没有明显的肉眼或一般光学显微镜可观察到的特征变化3、过去缺乏简氓.快速且可釜的检测方式4、细胞流通间缺乏品管，造成实验室间的相互污染5、研究或操作人员忽略污染问題支原体污染了来源：仁已受污染的细胞2、操作人员的疏失3、已受污染的培养基、血清4、操作环境不良、实验器具不洁等由于支原体为人体口腔中之正常菌丛，实验室之操作人员的污染亦可能为污染源，须十分注总C而万一细 胞已受支原体污染时，垠佳的

3、处理原则为将细胞岛压灭菌后丢弃，以免污染其它洁净的细胞株C但是若是 坚持要作去除支原体污染，有以下几种方法，只不过结果会与原始的细胞特性有差异。去除支原体污染：1、抗生素处理：BM-cyclin (Roche) , MRA (mycoplasma removal agent. ICN) . Ciprofloxcin (B ayer) Enrofloxacin (Bayer)2、Nucleic acid metabolites： 5-bromouraciL Hoechst 33258, bromodeoxyuridine3、Anti-sera预防与控制方面可从以下各点加强注意：设备方面：仁使用已

4、作支原体测试ok之细胞株2. 于另一隔离之区域操作未知是否有支原体污染之细胞3使用不添加抗生素的培养基培养细胞检测方而：定期以标准的支原体检测方法检测细胞、培养基、血淸、ddH20有否被支原体污染。实验操作人员之无菌观念与无菌操作技术之要求有关支原体污染之问题与回答：1、应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和支原体。主要的污染原因为无菌操作技术不肖. 操作室环境不佳.污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术.清洁的环境、与品质良好之细胞來 源和培养基配制是减低污染之最好方法。2、如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？直接灭菌后丢弃之。3、支原体(mycoplas

5、ma)污染的细胞，是否能以肉眼观察出异状？不能c除极有经验之专家外.大多数遭受支原体污染的细胞株.无法以其外观分辨之。4、支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数代谢及研究之任一数据。故进行实验前.必须确认细胞 为mycoplasmafree实验结果之数据方有意义。5、侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株c支原体之检测：直接培养法原理：直接培养支原体于培养基中观察其生长及菌落生成。特点：是目前最直接与灵敏之步骤，亦是用來评估其它侦测新步骤之标准步骤。缺点培养时间长.须35星期才能判断。有些支原体不能在培养基培养出來(例如M.

6、 hyorhinis)0需同 时培养支原体株作为正反应对照组，可能会造成污染。材料：dextrose. L-arginine HCk Difco PPLO broth (Difco 0554-17-1) horse serum、15% yeast ext ract solution (autoclaved)、Bacto agar、无菌有盖螺旋试管(autoclaved) 无菌培养皿(60x15mm)、L 玻棒、37C培养箱.厌氧缸(厌氧缸长期培养易有污染，所以厌氧包应用无菌水.每次打开厌氧缸后，用 70% ethanol擦拭内壁。)培养基制备：基本配方为 Difco PPLO broth(60

7、%),马血清(20%), 15% yeast extreat solution (10%), 10x stock sol ution (10%)o 由于培养时间长,可加入 penicillin(50u/ml)至 10x stock solution 或加入thallium acetate (1： 2000)至培养基中以防止其它细菌污染c 10x stock solution (1 liter):称取 50 g dextrose, 10 g L-arginine HCL 溶于 1 liter 蒸係水中。以 p m无菌过滤膜过滤灭菌。分装100 ml至瓶中，保存于70匸。液体培养基(1 liter

8、):称取 21 g 之 Difco PPLO broth, 0.02 g phenol red 于 600ml 蒸憐水中，加热 搅拌溶解之。灭菌12VC, 15分钟。待温度降低至室温后，于无菌操作台内加入200ml马血清，100ml 之15% yeast extract solution,及100ml解澜之10x stock solution混合均匀后,分装至已灭菌之有盖 螺旋试管中,伽I/管。保存于40期限1个月。固体培养基(1 liter )：称取 21 g 之 Difco PPLO broth. 0.02 g phenol red. 15g Bacto agar 于 600 ml蒸懾水中

9、.加热溶解之。灭歯12VC, 15分钟。放在50C水中浴中.待溫度降低至50C时，于无菌操 作台内加入 200ml 马血清 100ml 之 15% yeast extract solution 及 100ml 解冻之 10x stock solution, 混合均匀后，倒入60x50 m之无菌培养皿中，5ml/培养皿。保存于49,期限1个丿J。步骤：X1 ml细胞培养液或细胞悬浮液.接种于液体培养基中，習于37C培养二周，观察是否有混浊或是pH 值改变之情形。培养一周及二周后，分别取ml液体培养液涂在agar plate上，将其倒放置于37C厌氧箱 培养，培养至少3星期，持续观察是否有支原体之菌落出现。另取1 ml细胞培养液或细胞悬浮液，涂抹在agar plate上，379厌氧培养3星期.持续观察是否支原 体菌落岀现。另作正负反应对照组，正反应对照组为Acholeplasma laidlawii (ATCC 23206)与Marginini (ATCC 23838)o负反应对照组为待测细胞之新鲜培养基。结果判读：支原体生长较慢.所以先在液体培养基培养12周増殖后，再培养于agar plate上。需至少培养3星期 后，才可断定是否有支原体污染。所以整个测试需5个星期才知正确结果。典型之支原体菌落类似荷包蛋(fried- egg like),乃是由于支原体往a