兔巴氏杆菌-波氏杆菌二联蜂胶疫苗的研制及安全、效力试验

1、兔巴氏杆菌 -波氏杆菌二联蜂胶疫苗的研制及安全、 效力试验 兔巴氏杆菌 - 波氏杆菌二联蜂胶疫苗的研制及安全、效力试验 文章标题：兔巴氏杆菌 - 波氏杆菌二联蜂胶疫苗的研制及安全、效力试验 兔巴氏杆菌 - 波氏杆菌二联蜂胶疫苗的 研制及安全、效力试验 兔多杀性巴氏杆菌病（Pm）和兔支气管败血波氏杆菌病（Bb）是家兔的两种主要细 菌性传染病 , 它们传播迅速 , 一旦在兔场暴发流行 , 很难根除 , 经济损失惨重。 进行 疫苗接种是预防这两种疾病的最有效的措施。 免疫原性好的菌 （毒）种和良好的免 疫佐剂是保证疫苗免疫效力的必要条件。因此 ，在Pm和Bb基础菌种研究的基础 上,对蜂胶的提取工艺进

2、行了研究 ,选取了蜂胶乙醇提取液的水溶物作为佐剂 ,研 制疫苗 , 并进行了疫苗的安全及效力试验。现将该研究结果报告如下。 1材料与方法 1.1 仪器及材料 1.1.1菌种兔多杀性巴氏杆菌Pm90株（对家兔的致死剂量为8-10个活菌,对小鼠 的致死剂量为100个活菌）;兔支气管败血波氏杆菌Bb82株（对小鼠的致死剂量为 1X 107个活菌,对家兔的致病剂量为1 X 108个活菌）。 1.1.2 试验动物不同日龄的健康大耳白兔 1.1.3培养基含3小牛血清的马丁琼脂平板（SMS）、马丁肉汤（MB）、硫乙醇酸盐 培养基 （T.G）、酪胨琼脂（G.A）、葡萄糖蛋白胨汤（G.P）等。 1.1.4 细胞

3、瓶 1.1.5 蜂胶 1.1.6 仪器 GQ（F）75 管式分离机、索氏回流装置、温控式旋转蒸发器 1.2 试验方法 1.2.1Pm90菌液的制备及检验 1.2.1.1 一级种子的繁殖与鉴定用灭菌生理盐水适当稀释 Pm90株第9代冻干菌 种，接种于0.1绵羊血红素的马丁琼脂平板（BMS）上,37 C培养18h,然后选取5-10 个典型菌落,分别接种于 10绵羊鲜血琼脂斜面若干 ,同上培养后,作为一级种子。 在4C保存,可使用7日。继代次数不超过3代。 1.2.1.2二级种子的繁殖及鉴定将Pm90株一级种子接种于适量马丁肉汤中,置37C 振荡培养18h,取样用SMSS养基作纯粹检验；置4C保存,

4、可使用3日。 1.2.1.3制苗用菌液的培养将Pm9（株二级种子接种于SMS养基,37 C培养18h, 无菌水洗下菌苔 , 取样做纯粹检验 , 同时用平板菌落计数法计算菌液浓度 , 将菌液 浓度调整为200X 108个/ml。 1.2.1.4菌液的灭活加入0.4的甲醛溶液于菌液中，容器密封后,37 C灭活48h, 其间振摇 6-8 次, 然后进行灭活检验。本研究灭活检验及无菌检验用的培养基 为:SMS T.G、G.A和G.P。置37C条件下培养48h,无细菌生长说明已完全灭活。 1.2.1.5 菌液的离心、冻融灭活检验合格的菌液用管式分离机离心除去甲醛,无 菌刮下菌苔 , 用等量的灭菌生理盐水

5、配成原浓度的菌液。小量分装后反复冻融 3 次, 再次进行无菌检验。 1.2.2Bb82菌液的制备与检验将Bb82株第7代冻干菌种接种于BMS 养基 上,37 C 条件下培养24h,然后选5-10个典型菌落，分别接种于10绵羊鲜血琼脂斜面若干， 同上培养后，作为一级种子。置4C保存,可使用7日。继代不超过3代。二级种 子的繁殖以及制苗用菌液的培养、灭活、离心及冻融参照 1.2.1 1.2.3 蜂胶佐剂的制备经过工艺优化选择 , 我们采用了醇提水溶法来制备蜂胶佐 剂。蜂胶原胶在-20C冰柜中冷冻过夜使变脆，取出后研磨粉碎，放入深色瓶中， 按1:4的比例加入80的乙醇,充分搅拌,置70C索氏回流2h

6、,然后于旋转蒸发器 中50C浓缩成浸膏状。通过试验,选择合适的助溶剂,将蜂胶浸膏溶于pH7.4的 磷酸盐缓冲液（PBS）,然后配制成40mg/ml的溶液4C避光保存备用。 1.2.4配苗将上述Pm90菌液与Bb82菌液等量混匀后作为水相,蜂胶乙醇提取液 作为佐剂相 , 水相与佐剂相等量混匀后加入终浓度为 0.01 的硫柳汞 , 置胶体磨中 以8000r/min搅拌5min,然后120 xxr/min搅拌5min。无菌检验合格的,即可分装 至疫苗瓶中，加塞、封蜡置4C保存备用。实验室共生产兔巴氏杆菌-波氏杆菌二 联蜂胶疫苗 6批, 批号分别为 :010510、010521、010615、0106

7、28、010709和010720。 1.2.5 成品检验 6 个批次的兔巴氏杆菌 -波氏杆菌二联蜂胶灭活疫苗均进行了物 理性状、无菌检验以及安全检验。其中安全检验分 3 组进行, 每组均使用了不同 日龄（30、 90、 180天）的健康大耳白兔各 20只。接种后观察 3周, 记录家兔的临 床反应、体温以及是否有组织病变。 3 个组的试验设计如下 : 一次单剂量接种组 的疫苗接种量为2ml/只;单剂量重复接种组为2次接种，中间间隔1周,剂量为 2ml/只;一次大剂量接种组的疫苗免疫量为6ml/只,采用皮下多点注射的方式进 行。 1.2.6 兔巴氏杆菌波氏杆菌二联灭活苗的效力试验兔巴氏杆菌部分取

8、4 批二 兔巴氏杆菌 -波氏杆菌二联蜂胶疫苗的研制及安全、效力试验第 2 页 联苗（批号:010521 、 010615、 010709、 010720）, 分为 3个免疫剂量 :1 、 2、 3ml, 分别注射 1 月龄左右的健康家兔各 20只,5 只作正常对照。 3周后每只接种 Pm90 株致死量 , 观察 14 天, 记录每组的死亡数。 兔波氏杆菌部分取 4 批二联苗 （批号:010615、 010628、 010709、 010720）, 分为 3 个免疫剂量 :1 、 2、 3ml, 分别注射 1 月龄左右的健康家兔各 20 只,5 只作正常对 照。 3 周后每只接种 Bb82 株致

9、病量 , 以家兔咳嗽、鼻腔排出水样或脓样的鼻液 , 取鼻腔拭子能分离到Bb82株作为发病标准。观察14天，记录每组的发病数。 2 结果 2.1 疫苗的物理性状检验 本品为棕黄色均匀混悬液 , 长期静置后底部有少许沉淀 , 可混匀。 2.2 疫苗的无菌检验 待检菌液在 SMS、 T.G、 G.A、 G.P 培养基上进行无菌检验 , 均无细菌生长。 2.3 疫苗的安全性检验 各批次的疫苗接种家兔后 ,家兔的体温、食欲无明显变化 , 注射部位也无红肿及硬 结。 2.4 疫苗的效力试验 2.4.1 家兔对巴氏杆菌的免疫保护试验结果对照组的家兔在 3 天内全部死亡 ,从 兔体的心、肝、脾、肾中都分离到了

10、巴氏杆菌。2ml以上试验组的死亡保护率均 在 90以上（见表 1）。 表 1 家兔对巴氏杆菌的免疫效力试验 批次 攻毒保护率（） 1ml 组 2ml 组 3ml 组 对照组 010521 60 95 95 0 010615 60 90 100 0 010709 55 100 100 0 010720 65 95 90 0 2.4.2 家兔对波氏杆菌的免疫保护试验结果对照组的家兔在 3 天内全部发病并自 鼻腔拭子中分离到了兔支气管败血波氏杆菌 ,2ml 以上试验组的发病保护率均在 90以上（表 2）。 表 2 家兔对波氏杆菌的免疫效力试验 批次 攻毒保护率（） 1ml 组 2ml 组 3ml 组

11、 对照组 010615 70 100 90 0 010628 60 95 100 0 010709 75 100 95 0 010720 65 95 90 0 3 结论与讨论 3.1 关于菌液的生产工艺 制苗用兔巴氏杆菌及波氏杆菌菌液的培养采用了 （ 血清）马丁琼脂平板培养的方 法, 不仅容易得到高浓度的纯菌液 ,也避免了液体培养时菌液中非抗原物质对动 物机体的影响 ;菌液灭活后经管式分离机离心去甲醛 , 从而避免了疫苗中的非抗 原性化学物质对动物造成不必要的刺激 ; 离心后的菌液经反复冻融 , 可使细菌的 细胞壁破裂或通透性增加 , 细菌细胞内的多种抗原成分被释放出来 , 这样配苗时 各抗原

12、组分与蜂胶佐剂的相互作用更加充分 , 从而可增强疫苗的免疫效果。 3.2 关于蜂胶佐剂的提取工艺 蜂胶疫苗自问世以来 , 已在多种畜禽传染病的预防中得到应用。 遗憾的是 , 用于疫 苗佐剂的蜂胶 ,大多是蜂胶的乙醇粗提液。本研究中 ,我们采用了 80 的乙醇来提 取蜂胶 , 既能提取到蜂胶中的黄酮类等醇溶成分 , 又能保留一部分水溶性的活性 物质。所得的蜂胶醇提液用温控式旋转蒸发器蒸发掉乙醇 , 然后通过大量试验 , 选择了适当的助溶剂 , 使蜂胶浸膏可以以任意比例与水互溶 , 这样就避免了乙醇 对动物体强烈的刺激作用 ,增强了疫苗的安全性。 疫苗的效力试验表明 ,我们选择 的这种助溶剂不会降低蜂胶的佐剂效应。值得注意的是 , 目前市场上的蜂胶原胶 质量良莠不齐 ,