慢病毒转染手册研究

1、慢病毒(Lentivirus )载体是以HIV-1 (人类免疫缺陷I型病毒)为基础发 展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细 胞均具有感染能力。 基本概述 慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因 有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感 染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的 细胞，从而达到良好的的基因治疗效果， 在美国已经开展了临床研究，效果非常 理想，因此具有广阔的应用前景。 慢病毒的应用 目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质 体转染效

2、果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达 的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建 能够表达siRNA的载体,然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体 有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。 在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶川启动子来指导RNA合成的， 这是因为RNA聚合酶川有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。当RNA聚合酶川遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在 转录产物

3、3端形成14个U。U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶川依赖 的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达 21ntRNA 和50ntRNA 茎环结构(stem loop )。在siRNA 表达载体中，构成 siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成 siRNA ;也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体 包含位于RNA聚合酶川启动子和45T转录终止位点之间的茎环结构序列， 转 录后即可折叠成具有14个U 3 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成 siRNA。构建载体前通常要通过合成

4、 siRNA的方法，寻找高效的siRNA，然后 从中挑选符合载体要求的序列，将其引入 siRNA表达载体。 慢病毒载体 慢病毒载体(Lentiviral vector )较逆转录病毒载体有更广的宿主范围，慢病 毒能够有效感染非周期性和有丝分裂后的细胞。慢病毒载体能够产生表达 shRNA的高滴度的慢病毒，在周期性和非周期性细胞、干细胞、受精卵以及分 化的后代细胞中表达shRNA，实现在多种类型的细胞和转基因小鼠中特异而稳 定的基因表达的功能性沉默，为在原代的人和动物细胞组织中快速而高效地研究 基因功能，以及产生特定基因表达降低的动物提供了可能性。慢病毒作为siRNA 的携带者，不但具备特异性地使

5、基因表达沉默的能力，而且充分发挥了慢病毒载 体自身所具备的优势，为基因功能的研究提供了更强有力的工具。 慢病毒表达载体 包含了包装、转染、稳定整合所需要的遗传信息。慢病毒包装质粒可提供所 有的转录并包装RNA到重组的假病毒载体所需要的所有辅助蛋白。为产生高滴 度的病毒颗粒，需要利用表达载体和包装质粒同时共转染细胞， 在细胞中进行病 毒的包装，包装好的假病毒颗粒分泌到细胞外的培养基中，离心取得上清液后， 可以直接用于宿主细胞的感染，目的基因进入到宿主细胞之后， 经过反转录，整 合到基因组，从而高水平的表达效应分子。 慢病毒载体与其它常见病毒载体的特征比较 目前常用的病毒载体有腺病毒、逆转录病毒和

6、慢病毒。逆转录病毒载体只能 感染分裂期细胞，而且容量有限，腺病毒一般不能整合到染色体上，只能进行瞬 时感染。与其它逆转录病毒相比，慢病毒(LV)具有可以感染非分裂期细胞、 容纳外源性基因片段大，可以长期表达等显著优点。慢病毒不产生任何有效的细 胞免疫应答，可作为一种体外基因运输的工具。慢病毒载体介导的转基因表达能 持续数月，且无可观察到的病理学现象。1 病毒表达系统 腺病毒表达系统 慢病毒表达系统 逆转录病毒 病毒基因组 双链DNA病毒 RNA病毒 RNA病毒 是否整合 病毒基因组游离于 宿主基因组外，瞬 时表达外源基因 病毒基因组整合 于宿主基因组，长 时间、稳定表达外 源基因 病毒基因组整

7、 合于宿主基因 组，长时间、稳 定表达外源基 因 感染细胞类型 感染分裂和不分裂 细胞 感染分裂和不分 裂细胞 感染分裂细胞， 但在干细胞中 表达效率低 表达丰度 高水平表达 高水平表达 高水平表达 表达时间 快（1-2天） 慢（2-4天） 快（1-2天） 滴度 滴度高达 1012pfu/ml 最咼可达 109 10TU/ml 最咼可达109 10TU/ml 克隆容量 可插入高达8kb的 外源片段，滴度随 插入片段长度增加 而降低 可插入不超过 8kb的外源片段， 滴度随插入片段 长度增加而降低 可插入不超过 6kb的外源片段 免疫原性 高免疫原性| 低免疫原性 |低免疫原性 动物模型 不能得

8、到转基因动 物 可产生转基因动 物，效率达50以 上 可以，但很难 启动子 可以更换特异性启 动子 可以更换特异性 启动子 不需要启动子 能否用于 MIRCORNA 可以 可以 不可以 能否用于四环 素诱导 不可以 TET-ON, TET-OFF 不可以 系统的目的与意义 对于一些较难转染的细胞，如原代细胞、干细胞、不分化的细胞等，能大 大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增 加，这就为RNAi,cDNA克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 进行稳转细胞株的筛选； 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液； 解决的问题 对于一些较难转染的细胞，如

9、原代细胞、干细胞、不分化的细胞等 ,能大 大提高目的基因转导效率，而且目的基因整合到宿主细胞基因组的几率大大增 加，这就为 RNAi,cDNA 克隆以及报告基因的研究提供了一个有利的途径。 进行稳转细胞株的筛选； 为活体动物模型实验提供高质量的包含目的基因的病毒液； 在细胞相关的实验操作中，对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细 胞，通过病毒介导的实验能够大大提高基因的转导效率， 以达到目的基因的高效 瞬时表达。 细胞相关的实验 实验目的 对于一些按常规方法难以转染甚至无法转染的细胞， 通过病毒介导的实验能 够大大提高基因的转导效率，以达到目的基因的高效瞬时表达。 实验流程 1. 根据目的

10、基因相关信息（序列，序列号等） ，构建含有外源基因或 siRNA 的重组载体； 2. 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒； 3. 使用高效重组载体和病毒包装质粒共转染 293T 细胞，进行病毒包装和 生产，收集病毒 液； 4. 浓缩、纯化病毒液； 5. 用高质量的病毒液感染细胞； 6. 通过定量 PCR 精确测定病毒滴度（高精确滴定方法）和 Western 分析 实验结果； 7. 用高质量的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能或者 siRNA 的沉默效率 以及使用药物进 行稳定转染细胞株的筛选，通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达 稳定 性。病毒液足够用于一般的动

11、物活体实验。 慢病毒使用操作手册 1慢病毒使用操作 2慢病毒安全使用规范 3悬浮细胞感染方法概要 4相关专业术语 5细胞培养器皿的相关参数 1、慢病毒使用操作手册 1.1慢病毒的储存与稀释： 1.1.1病毒的储存：用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验， 可以将病毒暂时放置于4 C保存；如需长期保存请放置于-80 C （病毒置于冻存 管，并使用封口膜封口） A 病毒可以存放于-80 C 6个月以上；但如果病毒储存时间超过 6个月， 我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度 B 反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10% ;因此在病毒 使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻

12、融我们强烈建议客户收到病毒 后按照每次的使用量进行分装。 1.1.2病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后， 使用培养目的细 胞用PBS或无血清培养基（含血清或含双抗不影响病毒感染）混匀分装后4C 保存 （请尽量在三天内用完 ） 分装后使用 1.2 慢病毒用于体外（ In Vitro ）实验：感染培养原代细胞和建系细胞 1.2.1 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用 Invabio 提供的慢 病毒之前可以通过查阅相关文献， 了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性， 感染复 数（MOI值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。如果没有相关文献支 持，可以通过感染预

13、实验得到合适的感染复数（ MOI 值）（使用 24 孔板检测病 毒对目的细胞的亲嗜性） 1.2.2 慢病毒感染目的细胞预实验 1.2.2.1 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项 A 测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高 的细胞（HEK293T , Hela）作为平行实验的对照细胞。 B 在进行慢病毒感染实验时，可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释； 理论上，含有血清， 双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效 率。 C Invabio 提供的病毒单位为 TU/ml, 即每毫升中含有具有生物活性的病 毒颗粒数。如： 病毒滴度为 1X108 TU/ml 即每毫

14、升病毒液中至少含有 1X108 个具有生物 活性的慢病毒颗粒。 1.2.2.2 以 24 孔培养板为例，进行目的细胞和 HEK293T 细胞的感染预实验 实验前按照不同的 MOI 设置不同的感染孔， 并根据 MOI 和细胞数量计算所需要 的病毒量，如 有必要可以使用 PBS 溶液或者无血清培养基稀释病毒原液 第一天，准备细胞：在 24 孔培养板接种若干孔，每个孔内接种 35X104 个目的细胞，铺板时细胞的融合率为 50%左右，每孔培养基体积为100卩；进 行病毒感染时细胞的融合度约为 70%左右。 第二天，准备病毒：取出4C保存的病毒，使用台式离心机离心 20秒（使 病毒完全悬于离心管底部即

15、可）；如果是冻存在-80 C的病毒需要先在冰上融化 后使用。亦可以根据实验 室的实际情况将按照MOI准确计算好的慢病毒稀释到 培养基中，并尽可能保证所获得的含有慢病毒的培养基的总体积为最小体积， 以期获得最佳的感染效率。 第二天，感染目的细胞：病毒准备好之后，从培养箱中拿出细胞，首先观察 细胞生长状态，如细胞状态较好则开始实验 a使用移液器吸取准确体积的病毒液加入准备好的培养基 b吸去培养基的培养器皿中的培养基（如果细胞生长良好，密度适宜，则不 用换液） c在目的细胞和对照细胞中分别加入计算好的病毒液 d混匀后放于二氧化碳培养箱（37 C、5%CO2 ）孵育过夜 注：感染前细胞的状态好坏对最终

16、的感染效果高低影响很大，所以务必保证 加病毒之前细胞处于良好的生长状态 亦可以将预先准备好的培养基和慢病毒的 混合液直接加入培养器皿中 慢病毒对目的细胞的感染效率较低，通过提高 MOI值可以提高病毒的感染 效率，但是当MOI高于20时，我们建议客户在培养基中加入 ploybrene （8卩g/ml 左右）来提高病毒的感染效率。 A第三天，更换培养液：一般在 24小时候后将含有慢病毒的培养液更换 成正常培养液；在 感染后观察细胞状态，如果慢病毒对细胞有明显毒性作用而 影响细胞生长状态，可以最 短在加病毒4小时候更换新鲜培养液后继续培养（建 议在8-12小时更换为宜）。第一次换 液后，如果慢病毒对

17、细胞没有明显毒性作 用，按照正常培养条件培养换液。 B 第六天，感染效率检测：在 倒置荧光显微镜 观察荧光，估计慢病毒感染 目的细胞的效率； 如何由于目的基因较大而造成选择的载体不能携带Marker Gene的，可以 通过Real-time RT-PCR检测目的基因的表达来拍评估感染效率。 Invabio提供的病毒载体上带有 GFP绿色荧光蛋白，用户可以在病毒感染 96小时后用倒置 荧光显微镜观察GFP绿色荧光，以观察病毒对目的细胞的感 染情况。如果慢病毒载体携带其他Marker Gene如RFPBFP可以用荧光显微 镜在对应的激发光波长下观察荧光表达的情况 慢病毒表达时间较慢，荧光表达所需时

18、间较长，建议感染后 96 小时后观测 荧光表达。 感染后的细胞可以连续培养一周， 通过观察荧光的表达时间和表达强 度来确定慢病毒对目的细胞 的感染情况。感染期间请根据细胞生长的情况对细 胞进行及时换液，以保证细胞良好的生长状态。 2、慢病毒使用安全使用规范 Invabio 提供的慢病毒为 “自杀 ”性病毒，即病毒感染目的细胞后不会再感染 其他细胞，也不 会利用宿主细胞产生新的病毒颗粒。 慢病毒中的毒性基因已经被剔除并被外 源性目的基因所 取代，属于假型病毒因此没有毒性作用。 但该病毒仍然具有可能的潜在的生 物学危险， Invabio 建议不要使用编码已知或可能会致癌的基因的假型病毒。除非已经

19、完全公认某个基 因肯定没有致癌性，否则均不建议采用假型病毒进行生物学实验。 如有疑问， 请与我们联系。 使用时请参照如下所示进行实验： 2.1 病毒操作时最好使用生物安全柜。 如果使用普通超净工作台操作病毒， 请不要打开排风机。 2.2病毒操作时请穿实验服，带口罩和手套。 2.3操作病毒时特别小心不要产生气雾或飞溅。如果操作时超净工作台有 病毒 污染，请立即用 70%乙醇加 1%的 SDS 溶液擦拭干净。接触过病毒的枪头， 离心管，培养板，培养液请于 84 消毒液或 1%SDS 中浸泡过夜后弃去。 2.4用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培 养 板。用 70% 乙醇清理

20、培养瓶外壁后到显微镜处观察拍照。离开显微镜实验 台之前，用 70% 乙醇清理显微镜实验台。 2.5如需要离心，应使用密封性好的离心管，或者用封口膜封口后离心， 而且尽量使用组织培养室内的离心机。 2.6 脱掉手套后，用肥皂和水清洗双手。 3、悬浮细胞感染方法概要 1.1根据细胞的量将细胞在1.5ml管中离心收集然后用100-200ul的无血 清培养液稀释细胞 沉淀，以细胞完全浸没在培养基中为准 1.2按照MOI换算病毒颗粒数量，吸取病毒液加入细胞中，将1.5ml管放 在37 C度培养箱 中孵育30分钟 1.3将管中混合溶液吸出加到培养皿中或孔里 1.4加入足够量的新鲜培养液 1.512小时后换

21、液 1.696小时后观察细胞阳性率 4、相关专业术语 （详情可参考公司网站FAQ） 常用术语： MOI:病毒感染复数传统的MOI概念起源于噬菌体感染细菌的研究。其含义 是感染时噬菌体 与细菌的数量比值，也就是平均每个细菌感染噬菌体的数量。噬菌体的数量 单位为pfu。 一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。后来 MOI 被 普遍用于病毒感染细胞的研究中，含义是感染时病毒与细胞数量的比值，本 手册中提到的 MOI都是沿用这个概念。 然而，由于病毒的数量单位有不同的表示方式，从而使MOI产生了不同的 含义。能产生细 胞裂解效应的病毒例如单纯疱疹病毒等习

22、惯上仍用pfu表示病毒数量，因 此其MOI的含义 与传统的概念相同。 MOIstands for Multiplicity of Infection. It is the ratio of infectiousvirus particles to the number of cells being infected. The recommended MOI isin the range of 0.1 (mea ning that you ino culate 1 virus particle for every 10cells) to 0.01. The gen eral theory beh

23、 ind MOI is to in troduce one in fectiousvirus particle to every host cell that is present in the culture. However, more than one virus may infect the same cellwhich leaves a percentage of cells uninfected. This occurre nee can be reduced by using a higherMOI to en sure that every cell is in fected.

24、 5、细胞培养器皿的相关参数 Flask/Dish Surface (mm) Cell nu mber Media Volume 96 well plate 50 1.5-5.0 W 100 卩1 48 well plate 100 3.0 104-1.0 10 200 卩1 24 well plate 200 8.0 104-2.0 10 500 卩1 12 well plate 401 1.6-4.0 10 1.0 ml 6 well plate 962 3.0-8.0 10 2.0 ml 35mm 962 3.0-8.0 10 2.0 ml 60mm 2827 1.0-2.5 10 6.

25、0 ml 100mm 7854 2.5-6.4 10 10.0 ml 慢病毒载体的包装与纯化 1实验流程 制备慢病毒穿梭质粒及其辅助包装原件载体质粒，四种质粒载体分别进行高 纯度无内毒素抽提，共转染 293T细胞，转染后8 h更换为完全培养基，培养 48h后，收集富含慢病毒颗粒的细胞上清液，对其浓缩后得到高滴度的慢病毒浓 缩液，感染Hela细胞后定量PCR检测病毒滴度。体内和体外实验对慢病毒滴度 的要求不同，生产过程中可以通过浓缩得到不同滴度的慢病毒颗粒。 2实验材料 2.1慢病毒载体、包装细胞和菌株 慢病毒载体系统（Tronolab ）该病毒包装系统为四质粒系统，组成为 pRsv-REV，

26、pMDIg-pRRE，pMD2G,目的干扰质粒。其中目的干扰质粒能表 达绿色荧光蛋白（GFP）. pRsv-REV， pMDIg-pRRE，pMD2G含有病毒包装 所必须的元件 细胞株293T,慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养 基为DMEM（含10% FBS）。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 菌株大肠杆菌菌株DHa。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。 2.2主要试剂 试剂名称 生产厂家 化口 货号 包装细胞293T细胞株 中科院上海细胞所 大肠杆菌菌株DHa Invitrogen 公司 胎牛血清 Invitrogen 公司 胰蛋白酶 Invitrogen 公司 限

27、制性内切酶 Ferme ntas T4DNA连接酶 NEB公司 M0202V 质粒DNA提取试剂盒 Axygen公司 制备感受态试剂盒 BIOSCIENCES 凝胶回收试剂盒 Qiagen公司 1kb/100bpladder Ferme ntas 2.3主要仪器 仪器名称 生产厂家 化口 货号 PCR仪 Applied Biosystems 公司 电泳仪 Bio-rad 公司 荧光倒置显微镜 奥林帕斯 冷冻超速离心机 Hitachi 细胞培养箱 healforce 凝胶成像仪稳压DNA电泳仪 Tia nneng 恒温摇床 上海博讯仪器 电热恒温培养箱 上海博讯仪器 移液器 eppe ndorf 电热恒温水浴锅 上海一恒实验设备有限公司 数码凝胶处理系统 天能科学仪器 一次性平皿