A549细胞培养教程文件

1、A5 4 9 细 胞 培 养精品文档A549 细胞的培养A549细胞为人肺腺癌细胞，属于传代细胞系，可稳定地传代培 养。一般用胰酶消化后，加入生长液稀释，以 1： 21：3 传代培养 都是可行的。一、 所需溶液 1， 细胞冲洗液：磷酸盐缓冲液 （PBS）无 Ca、 MgNACL8.00g；KCL0.20g;KH2PO40.20g;Na2HPO4 . 。12H2O1.15g加水至 1 000mL, 将 PH调至 7.4 ，高压灭菌。2， 消化液（ 1）胰酶-PBS结晶胰酶 2.5g;高压灭菌后的 PBS 1000ml 用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过 0.22 m的滤膜过滤除 菌，分装备

2、用，放置 20保存。（2）胰酶EDTA:结晶胰酶0.5g;EDTA盐溶液0.2g无 Ca、 Mg PBS 1 000ml收集于网络，如有侵权请联系管理员删除精品文档用磁力搅拌器搅拌均匀，使其完全溶解，通过 0.22 m的滤膜过滤除 菌，分装备用，放置 20保存。3， 细胞培养液： RPMI 1640培养液配制方法：（ 1）将一袋干粉型 RPMI 1640培养基溶于 900ml三蒸水中，冲洗包 装袋两至三次倒入培养液中。（ 2）加入丙酮酸钠 0.1g ，NaHC2O 2g 以及双抗，加入磁力搅棒并置 于磁力搅拌器上充分搅拌。双抗的配置浓度为 100U/ML 青霉 素和 100U/ML链霉素。 （

3、一般市售的青霉素为 80 万 U/ 瓶，将 其溶解于 4ml 三蒸水中，每升培养液中加入 0.5ml ；市售的链 霉素为 100 万 U/ 瓶，将其溶解于 5ml三蒸水中，每升培养液 中加入 0.5ml） 。（ 3）调整培养液的值，用精密试纸观察. .即可。（ 4）过滤法除菌，所使用的滤器为 加压过滤， . 滤 膜，滤膜事先采用高压灭菌消毒。（5） 分装，加盖瓶塞，加封纱布报纸，用绳固定，放置 20保 存。二、细胞的维持和培养， 细胞的复苏收集于网络，如有侵权请联系管理员删除精品文档） 准备一个盛有温水的烧杯，从液氮罐中取出存有细胞的冻存管，放于温水中，用镊子夹住轻 轻摇动使其迅速融化。）10

4、00 000 r ， 3 min 离心。） 在无菌操作台中采用 75%的乙醇彻底擦拭冻存管，然后 打开冻存管，注意动作要轻柔。） 用 1ml 枪头将上清液去除，加入 1ml 预热的细胞培养液 将细胞吹散开，转移至 25cm2 培养瓶中。）补充 4ml的 RPMI 1640培养基，并且添加 10%的胎牛血清。） 倒置显微镜下观察， 37、 5%C2O培养。）24h 后，更换新的培养液。） 常规传代培养。， A549 细胞更换新的培养液（）无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。（）用 PBS反复冲洗细胞 23 遍。（）加入新鲜的预热好的培养液及 10%的胎牛血清。各种液体需要量（ ml）表面积2 2

5、 225cm 75cm 150cm洗涤胰酶 培养液3 5 101 2 132 55 10 20收集于网络，如有侵权请联系管理员删除精品文档（） 倒置显微镜下观察， 37、 5%C2O培养。， A549 细胞的传代（） 无菌操作打开培养瓶瓶盖，倒掉培养液。（） 向已经长满的细胞中加入消化液 1ml，轻轻摇动培养 瓶，使消化液流遍所有的细胞表面，吸弃或倒掉，轻轻冲洗细 胞表面 2遍，以尽可能去除原培养液中的牛血清。（）加入 1ml 消化液，在 37培养箱中孵育 5 min后把培养瓶放置在倒置显微镜下观察，发现细胞的胞质回缩、胞间 质增大后，立即终止消化。（） 加入 5ml 预热至 37的培养液，用

6、玻璃吸管反复吹打以 分散细胞。吹打过程按顺序进行，从培养瓶底部一边开始到另 一边结束，以确保所有的底部都被吹到。（） 吸取一半的细胞悬液，接种到新的 25cm2 培养瓶中，补 足培养液，并且添加 10%20%的胎牛血清。通常每瓶液体量 为 5 10ml。（） 倒置显微镜下观察， 37、 5%C2O培养。注意事项：（） 所有液体在加入细胞瓶前均应预热到 37。所有液体均 应调整 PH至 7.2 左右，均不能超过 7.4 。（） 细胞消化传代时吹打不要产生气泡，吹打力量不宜过 多，否则会损伤细胞。（） 严格执行无菌操作的要求。收集于网络，如有侵权请联系管理员删除精品文档（） 尽可能减少消化液剩余量，过多时会对细胞产生损伤， 可多添加些含牛血清的培养液中和。（） 培养瓶在室温中放置时间应尽可能短。， A549 细胞的冻存（） 消化已生长融合的单层细胞。（） 用生长液悬浮细胞，并且添加 10%的 FC