Bactobac表达系统中文版说明指导书

1、Bactobac表达系统中文版说明指导 书Bac-to-Bac杆状病毒表达系统试剂盒内容物:ProductCdtllOg LlOrExpression ControlBac-to-Bac7Expiieisicii System1035Q-016Supplied: 20 1 at 05 Lig / |il in TEt pH SL0 (10 pg total)pFastBac 1-CiiSupplied: 20 jil at 0.2 iig/ 讪 ii) TEh pH 8.0 (4 ng tatE)Bac-to-Bac Vector Kit10360-014pFastBclSupplied: 2

2、0 pl at 0.5 pg/)d in TEt pH 8,0 (10 jig total)pFastBac ：1-GusSupplied: 20 pl at 0.2 pg/pl hi TE, pH S O (4 ng total)BaoteBa卍 HT Vertoi Kit10584027pFastBacHT A pFastBicHT B pFastBLicHT 匚Supplied: 20 M each at 0.5 jig/nl in TE pH 8.0 10 jig total oi eadi vector)pFast 閑严HT-CTSupplied: 15 jil at 1 lig /

3、 皿 in TE pH 8.0 (15 ng total)pFastBac1 Dual10712-024pFastBacr: DualSupplied: 20 pl at 05 pg/pl iiiTE.pHSJ (10 Mg total)pFastBac Dual-Gus/CAT Supplied: 20 at CL2 ng/(l in TE, pH S O (4 ng total)Introduction:Overview:Bac-to-Bac杆状病毒表达系统提供快速有效的方法产生重组 杆状病毒。此方法基于让已经转入杆状病的质粒（杆粒）的位 点特意转座子的表达框的质粒在 Ecoli中扩增。B

4、ac-to-Bac杆 状病毒表达系统主要包括：*pFastBac捐献质粒的选择，它要能够产生包含目的位点的表 达结构，这个目的基因的产生被杆状病毒特意位点启动子控 制。* 一个Ecoli宿主，DH10Bac，包含杆状病毒质粒（杆粒）和辅 助质粒，在转染pFastBac表达结构后可以产生重组杆粒。* 一个控制表达的质粒，包括 Gus和/或CAT基因，以便在感 染细胞后产生重组杆状病毒，表达（3 -葡萄糖酸酐酶和/或氯霉 素乙酰转移酶。Bac-to-Bac表达系统的优点：使用这个系统产生重组杆状病毒较传统的同源重组有以下优占：八、*与使用同源重组产生重组杆状病毒所需的4-6周相比，鉴别纯化重组病毒

5、少于两周*减少了从斑点筛选重组病毒DNA所包含亲缘和非重组病毒的几率*可以快速同时进行大量重组，适合表达功能性研究的蛋白选择 pFastBac菌体（Vector）:大量的pFastBac菌体都适于进行Bac-to-Bac表达系统。选择 对于你的需要最合适的菌体。Vector特点参考pFastBac 1高水平表达的 强AcMNPV聚 乙烯（PH ）启 动子用于简单克隆 的大量克隆位 占八、Anderon 佃 96pFastBac HT高水平表达的Polayes 1996聚乙烯启动子； N-末端含有6XHis，可以用来纯化重组蛋 白，并可用TEV蛋白酶切 去；提供3个阅读 框pFastBac Du

6、al两个强启动子（PH 和 p10） 可以同时表达 两种蛋白； 两个大的克隆 位点Harris和Polaye 1997指南用途：指南提供了一个对于Bac-to-Bac表达系统的概述，并对以下提 供指导：1、克隆目的基因到pFastBac供体质粒的选择2、 转化pFastBa 结构到最高效的DH10BacTM产生重组 质粒3、转染重组质粒DNA到昆虫细胞产生重组杆状病毒4、 扩增滴定(Amplify and titer)杆状病毒株，使用病毒株 感染昆虫细胞表达目的重组蛋白重要的：Bac-to-Bac杆状病毒表达系统是用来帮助你产生重组 杆状病毒，在昆虫细胞中进行高水平表达目的基因的系统。虽 然他

7、可以帮助你很容易的产生杆状病毒表达你的重组蛋白，但是使用这系统更倾向于有杆状病毒生物学和昆虫表达背景的 使用者。我们高度推荐使用者具有病毒和组织培养的技术和知 识。Bac-to-Bac表达系统表达系统的成分：表达系统简单高效的产生重组杆状不能给党。基于 Luckow佃93年的方法，此系统利用了位点特意的专座子 Tn7 区简化和提高重组质粒DNA*系统的第一个成分是用来克隆目的基因的pFastBa菌株。基于pFastBacTM菌株的选择，表达基因被AcMNPV的PH或 p10启动子控制，在昆虫细胞内高水平表达表达框被 Tn7的左 右臂包围，并且包含一个庆大霉素抗性点和SV40多腺苷酸化信号，形成

8、一个微型的Tn7*第二个主要结构是Ecoli的DH10BacTM品系，用来作为pFastBac菌株的宿主。DH10BacTM细胞包含带有微型-attTn7靶位点的病毒质粒和辅助质粒（详细见下文）。一旦pFastBac表达质粒转入 DHIOBac细胞，转化就会发生在 pFastBac菌株的微型Tn7单位和微型-attTn7的靶位点之间 产生重组质粒。这个转化反应发生在辅助质粒提供的转化蛋白 处。如果你已经完成了转化反应，你需要分离这个高分子量的重组 质粒DNA并将质粒DNA转染如昆虫细胞趋产生重组杆状病 毒，用来进行初步表达实验。在杆状病毒株扩增和滴定后，高 效价的病毒株可以用来感染细胞， 进行

9、大规模的重组蛋白的表 达。杆状病毒菌株：病毒菌株（杆粒），bMON14272（136KB），在 DHIOBac Ecoli中包括：* 一个低拷贝的 微型F复制子*卡那霉素的抗性标记*一个来自于pUC载体的编码LacZa肽的DNA片段，用来接 触病毒转座子，Tn7 （微型attTn7）已经被插入。插入的微型 attTn7不会中断LacZa肽的阅读框。杆粒在具有卡那抗性的大的质粒 Ecoli DH10Bac中扩增，在显 色物质如Bluo-gal或X-gal和诱导剂IPTG存在时，能补充染 色体LacZ的缺失形成蓝斑（LacZ+）辅助质粒：DH10Bac Ecoli也包含辅助质粒，pMON7124（），他编码转移酶和四环素抗性基因。这个辅助质粒提供Tn7转化功能。图示Bac-toBac系统：下图刻画了重组病毒的产生和目的基因 的表达pFaglBac cfonor实验轮廓:Tr 刖RccmbnentDonor PlasmidAnlf