EDU细胞增殖检测

1、荧光显微镜检测方法 （以 96孔板， A549 贴壁细胞为例 ） 细胞培养 取对数生长期细胞，以每孔 410 31 10 5细胞接种于 96孔板中，培养至正常生长阶段。 药物处理 （可选 ）客户可以根据实验需要进行各种药物处理。 EdU 标记 1.1 用细胞培养基按 1000 ：1的比例稀释 EdU 溶液 （试剂 A） ，制备适量 50M EdU 培养 基； 注： 1）EdU 浓度与孵育时间相关，短时间孵育 （2h） 宜采用高浓度 （1050 M） ，长时间孵 育（24h） 宜采用低浓度 （110 M） ； 2）如果需配置 10M EdU 培养基，需调整为 5000 ： 1稀释比例； 3）配置

2、好的培养基的保存时间取决于培养基的性质。 表 1 EdU 培养基及染色反应液的使用量参考 96 孔板 * 48孔板 24孔板 12孔板 6孔板 5.5 cm 小皿 EdU 培养 基 100 l 150 l 200 l 300 l 500 l 2 mL 染色反应 液 100 l 150 l 200 l 300 l 500 l 2 mL 注：1）* 表示贴壁细胞通常采用的培养容器， EdU 培养基与染色反应液用量以覆盖细胞为宜； 2） 悬浮细胞 EdU 用量依据培养体积而定。 1.2 每孔加入 100L 50M EdU 培养基孵育 2小时，弃培养基； 注： 1）最佳孵育时间与细胞周期相关 （表 2

3、），大多数细胞系均可采用 2小时孵育时间； 2）EdU 培养基用量以没过细胞为宜，但需要保证 EdU 孵育时间内的营养物质持 续供给 （表 1）； 1.3 PBS 清洗细胞 12次，每次 5分钟。 注：清洗目的是将未渗入 DNA 的 EdU 洗脱，清洗方式依据不同的细胞类型而定，贴壁 不牢的细胞请降低清洗强度。 表 2 EdU 孵育时间设定参考 3T3 Hela HEK293* 细胞系 人胚胎细胞 酵母细胞 人成纤维细 胞 人宫颈癌细 胞 人胚肾细胞系 人神经细胞 细胞周期 30min 3h 18h 21h 25h 5d 孵育时间 5min 20min 2h 2h 2h 1d 注： 1)EdU

4、 孵育时间取决于细胞周期， 一般为细胞周期的 1/10 至1/5，但大多数细胞系均可 采用2h 孵育时间。孵育时间越长，细胞增殖数量就越多； 2)* 考虑到细胞培养基、温度、湿度、光线等其他因素的影响，具体实验的细胞 群体细胞周期会有所变化。 表 3 细胞实验 EdU 孵育浓度及时间参考 PubMed ID Reference Cell line Concentration Time 1827249 2 Salic A, et al. PNAS . 2008 NIH3T3, Hela 10 nM10 M 1 hr 1852191 8 Cappella P, et al. Cytometry A

5、 . 2008 HL-60, A2780, U2OS 110 M 30 min 1899641 1 Chehrehasa F, et al. J Neurosci Methods . 2009 Neurospheres 120 M 24 hr 1917937 1 Limsirichaikul S, et al. Nucleic Acids Res. 2009 Primary fibroblasts 10 M 1,2,4 hr 1925339 6 Warren M, et al. Dev Dyn . 2009 Chick embryos 10 M2 mM 4 hr 1964774 6 Yu Y,

6、 et al. J Immunol Methods . 2009 Spleen cells 50 M 24 hr 1954441 7 Momcilovi ? O, et al. Stem Cells . 2009 Human ES cells 10 M 30 min 2008070 0 Cinquin O, et al. PNAS . 2010 emb-30 1 M 12 hr 2002588 9 Han W, et al. Life Sci . 2009 VSMC 50 M 2 hr 2065970 8 Huang C, et al. J Genet Genomics . 2010 ESC

7、50 M 2 hr 2131071 3 Hua H, et al. Nucleic Acids Res . 2011 fission yeast strains 10 M 3 hr 2082449 0 Lv L, et al. Mol Cell Biochem . 2011 EJ cells 50 M 4hr 2124828 4 Yang S, et al. Biol Reprod . 2011 GC cells 50 M 2 hr 2122792 4 Zhang YW, et al. Nucleic Acids Res . 2011 U2OS, HT29 30 M 90 min 218296

8、2 1 Guo T, et al. PloS One . 2011 HIT-T15 50 M 4hr 2198043 0 Zeng T, et al. PloS One . 2011 MCF-10A 25 M 2hr 2201257 2 Ding D, et al. Int Orthop . 2011 C3H10T1/2 10 M 24hr 2200078 7 Zeng W, et al. Biomaterials . 2011 EPC 50 M 4hr 2191321 5 Xue Z, et al . J Cell Biochem . 2011 SGC7901 25 M 24hr 22016

9、03 8 Peng F, et al. Lasers Med Sci . 2011 MSC 50 M 2hr 2187863 7 Li D, et al. J Biol Chem . 2011 HCC 50 M 2hr 注：如果您有采用 BrdU 进行实验的经验，可以参照 BrdU 实验的相关参数进行 EdU 实验。 细胞固定化 2.1 每孔加入 50L 细胞固定液 （即含 4% 多聚甲醛的 PBS） 室温孵育 30分钟，弃固定液； 注：1）低浓度的多聚甲醛有利于细胞结构的保持，当需要抗体染色时， 需采用 Triton X-100 透化细胞以利于抗体进入细胞内。 2）可采用其他方式进行细胞固定

10、。 2.2 每孔加入 50L 2 mg/mL 甘氨酸，脱色摇床孵育 5分钟后，弃甘氨酸溶液； 注： 目的是中和多聚甲醛， 保证染色反应体系， 当采用其他方式进行细胞固定时可酌情省 略此步骤； 2.3 每孔加入 100 L PBS ，脱色摇床清洗 5分钟，弃 PBS； 2.4 （加强）每孔加入 100 L渗透剂 （0.5% TritonX-100 的PBS）脱色摇床孵育 10分钟;PBS 清 洗1次， 5分钟。 注： 当实验需要进行其他抗体染色时， 或由于某些细胞类型对染料的吸附性较高， 可能需 要增强细胞膜通透性。普通细胞可以省略。 Apollo 染色 3.1 每孔加入 100 L 的1X A

11、pollo ? 染色反应液 （表3），避光、室温、脱色摇床孵育 30分钟 后，弃染色反应液； 注： 1） 染色液用量与细胞量相关，以覆盖细胞为宜（表1） ； 2） 孵育时间可以进行适当调整，调整范围为 1030 分钟。 表 4 Apollo ? 染色反应液的配置参考 （ 现用现配 ） 配制顺序 Apollo ? 染色反应液 500 L* 1 mL 5 mL 10 mL 1 去离子水 469 L 938 L 4.69 mL 9.38 mL 2 Apollo ? 反应缓冲液 （试剂 B） 25 L 50 L 250 L 500 L 3 Apollo ? 催化剂溶液 （试剂 C） 5 L 10 L

12、50 L 100 L 4 Apollo ? 荧光染料溶液 （试剂 D） 1.5 L 3 L 15 L 30 L 5 Apollo ? 缓冲添加剂 （试剂 E） 5 mg 9 mg 44 mg 88 mg 注： 1）*表示通常配制的 Apollo ? 反应液的体积足以进行 5 10个孔（96孔板）染色； 2） 按顺序配制适量 1X Apollo ? 染色反应液，以免破坏正常的反应体系（现用现配， 30 分钟用完 ）； 3） 试剂 E 为白色粉末，较易氧化，使用后请旋紧管盖，如试剂出现棕黄色，则需 更换； 粉末较难准确称量，称量误差范围可稍微放宽，但不应超过20% 。 3.2 加入 100 L 渗

13、透剂 （0.5% TritonX-100 的 PBS） 脱色摇床清洗 23 次，每次 10分钟， 弃渗透剂； 3.3 （加强）每孔每次加入 100 L 甲醇清洗 12次，每次5分钟； PBS 清洗1次，每次 5分钟。 注： 由于某些细胞对染料的吸附性较高， 需采用加强方式洗脱以降低染料背景。 普通实验 可以省略。 DNA 染色 4.1 用去离子水按 100 ：1的比例稀释试剂 F，制备适量 1X Hoechst33342 反应液，避光保 存； 4.2 每孔加入 100 L 1X Hoechst 33342 反应液，避光、室温、脱色摇床孵育 30分钟后， 弃染色反应液； 4.3 每孔每次加入 100 L PBS 清洗13 次； 4.4 客户可选择进行其他染色步骤，否则每孔加入 100 L PBS 保存待用。 其他染色 （自备 ） （可选 ）客户可以根据实验需要进行细胞表面或细胞内抗原的抗体染色（注：染料兼容性请参 照表 4） 。 图像获取及分析 建议染色完成后立即进行观测 ;如果条件限制，请避光 4 湿润保存待测，但不应超过 3 天。 注：调试仪器时，请将曝光时间调整为 30ms 左右，尽量不要 1s 。 表 5 配套染料的相关波长信息 C0003