TIRFM使用及初步试验-中国科学院力学研究所

1、TIRFM在纳米粒子近壁浓度测量中的应用王绪伟 李战华100190中国科学院力学研究所非线性力学国家重点实验室，北京摘要 ：相比于传统的体照明方式，全内反射（ TIRF）照明具有背景干扰小、 垂向分辨率高等优点， 可用于定量观测液 -固界面的流动现象。 本文介绍 LNM 实 验室 TIRFM 系统调试中的技术参数，初步测量了距离玻璃表面 500nm 高度内 200nm粒子的浓度分布，并与经典的 Boltzmann 公式进行比较。1. 引言Aranuld Serge（2008）1 利用粒子的细胞表面的受限运动理论绘制了细胞 表面形貌的动态变化；郑旭等（ 2009）2使用 Micro-PIV 实验

2、测量微流道壁面的 滑移长度，发现示踪粒子浓度在管道壁面的非线性分布可能引起表观滑移长度偏 大。这些现象引起了人们对粒子 -壁面相互作用的关注 1-3 ，而粒子浓度在近壁区 的非均匀分布，也称为 depletion layer，是其中的一个基本问题，但是对与近壁 粒子浓度的直接测量比较困难。近几年得到迅速发展的全内反射隐失波（TIRF）技术4照明范围在距离壁面 500nm 以内， z向分辨率可达 30nm，可有效用于近 壁区粒子浓度分布测量。本文主要介绍了 TIRFM 测量中的技术问题，并初步使用 TIRFM 测量距玻 璃表面 500nm 以内的 200nm 粒子在纯水中的浓度分布。2. TIR

3、F 原理及参数调整（1）TIRF 原理根据 Snell 透射定律：当光线从介质 1 进入介质 2 时，介质的折射率与光线入 射角或折射角的乘积守恒（图 1L），用数学表示为其中 n1和 n2为介质 1 和介质 2 的折射率， 1和 2分别为光线入射角和折射角。 当折射角 2为 90o时，没有光进入介质 2,称为全反射，相应的入射角称为临界角(1)作者简介： 王绪伟（ 1984-），男，甘肃会宁人，博士生。研究方向：纳米粒子受限布朗运动。Email:基金项目 ：国家自然科学基金项目（ 10872203）和中科院知识创新工程（ KJCX2-YW-H18 ）

4、n2cr arcsin( 入射角与调节器刻度的关系 入射角的大小是由 TIRF 照明器的调节器控制的。 厂家给出的入射角与调节 器刻度之间的关系为2(a b)sin (6 n1 f其中 a和 b分别为光束平行于物镜折射和有一定偏斜折射时的刻度， f为物镜焦 距(为3)。但使用中发现， a和 b与所使用的实验系统有关。我们重新标定了调 节器刻度 b 与入射角 的关系，如图 2所示。 )(2)n1水的折射率 n2=1.33，玻璃 n1=1.52，可以得到临界接触角 cr 为 61.4 度。对给定 的物镜，最大入射角由物镜的数值孔径 NA 确定m a x ar csiNnA(3)24n1对 100X

5、 NA=1.45 的油镜，最大入射角为 72.5 度。当入射角范围为 crmax 时，绝大多数光发生全反射，但有一部分光会以平行界面的方向传播，称为隐失波(图 1)。TIRF 照明厚度内光强 I(z)(即隐 失波强度)分布为：zI( z) I(0)edp(4)其中 I(0)为壁面( z=0)处的光强，照明厚度的特征尺度称为穿透厚度 dp(5)图2 入射角与 TIRF 调节器刻度 b的关系其中 为激发光的波长。对 532nm 激光，对应于不同的入射角，穿透厚度的取值 范围为： 72340nm。(7)拟合得到入射角与 TIRF 调节器刻度 b 的关系为：sin =0.38b-7.3(3) 穿透深度

6、与 z 向分辨率根据公式 (3)，通过测量粒子光斑的光强 I(z)可以得到粒子在 z向的位置，从 而实现对粒子的三维追踪。根据误差传递， z 向定位的误差：z dp I 0(8)I0对于粘附在壁面的粒子，光强 I0=5000 时， Io=400，可得入射角 =61.4时，误 差 z=31nm。3. 实验装置与方法实验装置包括 Olympus IX71倒置荧光显微镜，配有数值孔径 NA=1.45的 100 倍 TIRF 油镜；物镜型 TIRF 照明器 IX2-RFAEVA2(Olympus)；激光器 Compass 315M( Coherent)；图像采集用 DU885 EMCCD(Andor)

7、 。实验用直径 200nm 的 Polystyrene 荧光粒子 (Invitrogen)，粒径的误差 2%。在超纯水 (Millipore) 中稀释 至体积分数约为 10-5。荧光粒子的实验溶液配置好后 5-10min 内开始实验。将约 50 L 含纳米荧光 粒子的溶液滴到载玻片上， 液滴的直径约 3mm。用 CCD 记录液滴中的荧光粒子， 在 bin2 模式下图幅为 501502 像素，像素尺寸为 160nm/pixel 。实验示意见图 3。 在同一平面内，观测 5-7 个位置，每一空间位置连续拍摄 50 帧图片，连续两帧 的时间间隔 t为 24.05ms,其中包括图像曝光时间 (3ms)

8、和图像传输时间。实验持 续时间为 20-25min。典型的粒子图像如图 4 所示。用 3 个液滴重复上述实验。环境的相对湿度为 40%-50%，每次实验中，湿度 偏差小于 4%。实验温度在 22-23.5 0.1，单次实验过程中温度变化小于 0.3。使用单粒子追踪法 5对图像进行粒子识别、 轨迹匹配后得到 50 帧图像中所有 光斑在 x-o-y 平面内的位置和光斑最大灰度。 TIRFM 中粒子光斑的灰度可以转换 为 z 向位置(公式 4)，由此可以进一步得到粒子浓度随 z 向的分布。图 3. 物镜型 TIRF 照明实验示意图图 4. TIRF 照明下 200nm 粒子图像4. 近璧粒子浓度测量

9、(1) Boltzmann 分布公式C.I. Bouzigues(2008)6认为， 纳米粒子在固体表面附近的浓度分布主要是 由于粒子 -壁面的静电排斥作用引起的。在水溶液中，固体表面会吸附 /脱附化学 基团，从而产生表面电势。带电表面附近的电势分布为(z)4kBTearctanh tanhe0e4kBT(9)其中kB为Boltzmann常数， T为绝对温度， 0为固体表面电势， D为Debye长 度。 在电势场 中，点电荷的浓度分布服从 Boltzmann 分布qp (z)C(z) C0e kBT(10)其中 qp 为粒子表面电荷量。(2) TIRFM 测量结果我们对 200nm的粒子在近壁

10、面的浓度进行测量， 3 次实验得到的结果如 图 5 所示。左图为原始数据，其中各次实验测差异是由于每次配液中浓度不尽 相同。为了显示粒子 -壁面相互作用的效果，我们使用 500-600nm 切片厚度内 粒子数密度的均值对原始数据分别进行归一化(右图) ，可以看出它们的规律 一致。图 5 粒子浓度沿着 z向的分布。 (L)归一化前 , (R)使用最后 5 个数据的均值归一化(3) 与理论 Boltzmann 分布的比较理论上，超纯水中的 Debye长度在考虑 pH 影响时为 150nm7，粒子表面电 荷约-3e，玻璃的表面电势约 -40mV，代入式( 9)和( 10)可得到理论分布如图 6 所示

11、，可见理论与实验结果的趋势一致。图 6 近壁粒子浓度分布5. 结论本文对 LNM 实验室的 TIRFM 系统进行了调试，给出了入射角标定公式并 对 z 向定位精度进行了分析。利用该系统进行了200nm 粒子在近壁区浓度分布的测试。测试结果表明，利用 TIRFM 系统测量得到的粒子浓度在 z 向分布的形 式基本符合 Boltzmann 分布，但其中参数的确定还需要进一步的研究。参考文献1 . A. Serge, N. Bertaux, H. Rigneault and D. Marguet, Dynamic multiple-target tracing to probe spatiotempo

12、ral cartography of cell membranes . Nature Methods, 2008, 5(8): 6876942 . X. Zheng and Z. H. Silber-Li, The influence of Saffman lift force on nano-Particle s concentration distribution near wall , Applied Physics Letter, 2009, 95(12): 1241053 . Simon Biggs, Dennis C. Prieve and Raymond R. Dagastine

13、, Direct Comparison of Atomic Force Microscopic and Total Internal Reflection Microscopic Measurements in the Presence of Nonadsorbing Polyelectrolytes , Langmuir, 2005, 21 (12): 5421 54284 .A. Daniel, Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology , 2001, 2(11): 764-7745 .王绪伟，李战华 . SPT方法在纳米粒子布朗运动观测中的应用 . 实验流体力学， 2008，22(1): 8487.6 .C.I. Bouzigues, P. Tabeling and L. Bocquet, Nanofluidics in the