蛋白相互作用PullDown实验

1、蛋白相互作用Pull-Down实验实验原理：Pull-Down技术是通过蛋白相互作用来研究细胞通路的有力工具。是 确定两种或更多蛋白之间相互作用的体外方法。Pull-Down实验可用来检测已知的蛋白相互作用条件，并且可用来筛选未知的蛋白相互作用。用作诱饵的蛋白是重组蛋白，会含有一个用于纯化的亲和标签。这个融合标 签就是用于Pull-Down实验的基础。最常见的标签为谷胱甘肽 S-转移酶（GST） 和多组氨酸（6和is）。其分别使用固相化的谷胱甘肽和固相化的金属螯合物亲和 配体（如 皿2+和Co2+）。Ptiase 1In vitro Proy Protein Synlhosis(TNT*T7S

2、ySln)PhasB 2Immobilization of Bair tG ST-fusion)Prolein onto ManeGST Panides爭I &proy prntGin detociedWaihWashEluteJ|gst|-C + GFigure 1 Overview of the MjgneGST Pall-Down System piotocoL P h Prey Protein, M = MagneGST PjtftKk.实验准备：实验仪器：谷胱甘肽琼脂糖凝胶（镍离子琼脂糖凝胶） 、离心机、 实验材料：表达的含标签的纯化蛋白、细胞裂解液实验试剂：Binding Buff

3、er/Washing Buffer: Na2HPO4、2mM KH 2PO4、140mMNaCl、10mM KClSDS loading Buffer: 50mM Tris-Cl、2%SDS、%溴酚蓝、10%甘油、10mM DTT裂解缓冲液： 20mM Tris-Cl、200mM NaCl、1mM EDTA（）、 % NonidetP-40 使用前加入加入蛋白酶抑制剂。（蛋白酶抑制剂：2ug/ul抑肽酶（aprotinin ）、1ug/ul白胃素（ leupeptin）、 ml 胃酶抑素（ pepstatin）、 25ug/ml 苯甲磺酰氟（ PMSF）实验方法：方法一：1 、预清除细胞裂解液

4、：将细胞裂解液与50ul的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25ug GST在4C混 合孵育 2h。离心机12,000g在4C离心2min。将上清转移至新的离心管中。2、探测细胞裂解液两个含等量预清除细胞裂解液及 50ul 谷胱甘肽琼脂糖球珠的微量离心管。 在 一管中加约10ug的GST蛋白，另一管中加约10ug的GST融合探针蛋白。 两个反应中加入的探针和对照蛋白质的量应该是等摩尔的。将离心管在 4C 翻转混合孵育 2h。最大速度在4C离心样品2min。在新的微量离心管中收集上清。用1ml冰冷的裂解液洗球珠。在离心机上以最大速度离心1ml。弃去上清。重复洗三次。加入50ul 20mmol/L的还

5、原型谷胱甘肽到球珠中，洗脱 GST融合蛋白及任何 与其结合的蛋白质。在离心机上最大速度离心 2min。3、检测相互作用蛋白质将样品煮沸4min，进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。方法二：1、5ug目的GST融合探针蛋白和GST蛋白分别和谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠 在4C孵育结合30min。2、结合 GST 融合探针蛋白的谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠与 100ul 细胞裂解液 结合在4C作用4h。3、3000rpm在4C离心5min，除去上清。4、 用洗涤缓冲液重悬谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠，3000rpm在4C离心5min, 除去上清，重复 5 次。5、取谷胱甘肽琼脂糖凝胶球珠进行 SDS-PAGE电泳分析

6、。方法三：实验试剂： PBS（140mM NaCl、 KCl、 10mM Na2HPO4、 KH 2PO4）Elution Buffer: 50mM Tris-Cl 、 10mM 还原型谷胱甘肽0.154g溶解到 50ml 50mM Tris-CI 中配制 Elution Buffer。1 、细胞裂解取 1ml 细菌培养液离心去上清，加 200ul 细胞裂解液到菌丸，在室温下重 悬并轻柔的混匀。将其在室温下晃动孵育20-30min。2、固定 GST 融合蛋白到柱子上将谷胱甘肽琼脂糖凝胶颠倒混匀后取 20ul 到离心管中，小心去除上清，加 250ul Binding Buffer或wash Bu

7、ffer到凝胶中，混匀。重复洗 3次以上。平衡好的凝胶用 100ul Binding Buffer 或 wash Buffer 重悬。加 200ul 含 GST 融合蛋白的细菌裂解液，在旋转的台子上室温下孵育 30min。小心移去上清， （保存以便分析， ）将 250ul Binding Buffer 或 wash Buffer 加到凝胶中，轻柔混匀，在室温下孵育5min。小心移去上清。加入250ulBinding Buffer 或 Washing Buffer 再次清洗，将凝胶用 20ul Binding Buffer 或 wash Buffer 重悬。3、捕获猎物蛋白将 5ul 固定 GS

8、T 融合蛋白的凝胶中加入 20ul 含猎物蛋白的溶液，将 155ul Binding Buffer 或 wash Buffer 和 20ul 10%BSA 加入凝胶中，在室温下旋转孵 育1h。移去上清。将 400ul Binding Buffer 或 wash Buffer 加入凝胶中， 轻柔混匀， 在室温下孵 育5min，移去上清。加400ul Binding Buffer或wash Buffer再次清洗凝胶。 小心移去上清。分析：加20ul SDS-PAGE loading Buffer,在室温下混合5min。取出上清用于 分析。His Pull-Down 方法 实验试剂：Binding

9、Buffer: 20mM Tris-Cl 、150mM NaCl、20mM 咪唑Elution Buffer: 20mM Tris-Cl 、300mM NaCl、500mM 咪唑 实验步骤：I 、结合蛋白裂解后，经滤膜过滤，2、与Ni-NTA树脂（1ml蛋白裂解液上清结合5ul树脂）4C混合孵育3h3、待树脂沉淀后用 10倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液洗去杂蛋白。4、用 6 倍柱体积镍柱洗脱目的蛋白。5、纯化后的蛋白用PBS和超纯水透析，冻干。6、SDS-PAGE电泳分析7、纯化的蛋白与 Ni-NTA 树脂冰浴作用 2h，8、10 倍柱体积洗涤缓冲液洗涤，9、然后加入过量 100ug/ml 蛋白溶液

10、，冰浴作用 2h，10、用 10 倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液清洗，II 、加入 1 倍柱体积洗脱缓冲液洗脱，12、洗脱蛋白进行SDS-PAGE和Western-blot分析鉴定。13、阴性对照为结合蛋白溶液加入 Ni-NTA 树脂中冰浴作用 2h。 1 0倍柱体积的镍柱洗涤缓冲液清洗，加入 1 倍柱体积洗脱缓冲液洗脱， 注意事项：1、所有过柱的液体都要经过或的滤膜。2、平衡柱子：用 3-5 个柱体积蒸馏水洗柱用 3-5 个柱体积的 binding buffer 平衡柱子。3、洗柱： 如谷胱甘肽琼脂糖凝胶的柱子失去结合能力，需要洗去柱子上的杂质 3.1除去变性物质， 用 2个柱体积的的 6M 盐酸胍洗柱子， 然后用 5个柱体积的 PBS 洗柱3.2除去疏水