荧光实验二同步荧光法同时测定色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸2

1、实验二用同步荧光法同时测定色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸 、实验目的 1. 了解等波长差同步扫描技术。 2. 学习用不同荧光法测定多组分混合物的方法。 二、实验原理 色氨酸(Try)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)是天然氨基酸中仅有的能发射 荧光的组分，可以用荧光法测定。但由于三者的激发光谱和发射光谱互相重叠， 常规荧光法不能实现混合物中这三种组分的分别测定。同步扫描荧光光谱技术具 有简化、窄化光谱、提高选择性等优点。等波长差(入=入erm入eX同步扫描技术 可以通过入的选择，实现多组分混合物的选择性测定。研究表明，当仅有酪氨 酸和色氨酸共存时，分别利用酪氨酸(入v 15nm和色氨酸( A 6

2、0nm)特征 的同步扫描光谱可以实现这两组分的分别测定。当同时含有这三种氨基酸时，可 以在pH7.4的缓冲介质中，以入=55nm进行同步扫描，禾I用苯丙氨酸 217nm, 酪氨酸232nm和色氨酸284nm的同步荧光峰进行分别测定。测定范围是苯丙氨 酸：0.075mg/mL;酪氨酸0.021mg/mL;色氨酸0.0010.5mg/mL。酪氨酸 在268nm处的同步荧光峰对色氨酸的测定有一定干扰，但可以校正。 三、仪器与试剂 1. 仪器 F-4500型荧光光度计，25mL带玻璃塞的比色管，吸量管 2. 试剂 (1) 色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸标准溶液：先配制 0.5mg/mL标准溶液，再逐级 稀释

3、配制含色氨酸1ug/mL ；含酪氨酸2ug/mL和含苯丙氨酸10ug/mL的工作溶 液。 - 一 1 (2) pH7.4 的 KH2PO4 NaOH 缓冲液：0.5mol NaOH 溶液与 0.5mol 1KH 2PO4按4:5体积混合而成。 四、操作步骤 1. 荧光激发、发射光谱及同步光谱的测定 分别移取苯丙氨酸(4.0mL)、酪氨酸(8mL)和色氨酸(4.0mL)标准溶液于三 支25mL比色管中，各加入2mL pH=7.4的KH2PO4 NaOH缓冲液，用水稀释至 刻度摇匀，测定其荧光激发、发射和同步（入=55nm光谱。确定其峰值波长 和强度。 2. 混合溶液荧光激发、发射光谱及同步光谱的

4、测定 移取4.0mL苯丙氨酸、8mL酪氨酸和4.0mL色氨酸标准溶液于一只 25mL 比色管中，加入2mL pH=7.4的KH2PO4 NaOH缓冲液，用水稀释至刻度摇匀， 测定其荧光激发、发射和同步（入=55 nm光谱。确定其峰值波长和强度。并 与步骤1中图谱加以比较。 1、3.波长差入的确定： 移取4.0mL苯丙氨酸、8mL酪氨酸和4.0mL色氨酸标准溶液于一只 25mL 比色管中，加入2mL pH=7.4的KH2PO4 NaOH缓冲液，用水稀释至刻度摇匀， 测定其同步（入=40 50、60、70nm,怎=210）光谱。并记录扫描结果。其中 苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸分别对应 217nm,

5、232nm和284nm的同步荧光峰强 度。 注意: 入的选择直接影同步荧光峰的峰形、峰位和强度，实验中应保持一致 五、数据处理 1.从激发和发射光谱中找出最大激发波长和最大发射波长值，以及它们相对应 的峰高。 2 在它们的同步荧光光谱中也确定最大波长和对应的峰高 六、思考题 1. 同步扫描荧光技术有哪些优点？ 2. 观察激发波长的整数倍处荧光发射光谱在有何特点？该波长是否适合于进行 定量分析？ 3. 通过两种氨基酸的化学结构，是否可以不经试验判断其荧光强度的大小次序 COOH NH2 色氨酸 苯丙氨酸 4比较紫外分光光度法和荧光分析法的区别和各自的优缺点 附加思考题: 测定混合液中三种氨基酸的

6、含量时，若混合未知液中不含酪氨酸，则未知液 中色氨酸的含量，可根据其同步扫描 284nm处的同步荧光信号强度，由色氨酸 的工作曲线确定；但若样品中含有酪氨酸，由于色氨酸在284nm处的同步荧光 信号受到酪氨酸268nm处的同步荧光峰的影响，测定结果将偏高，偏高程度随 酪氨酸含量增加而增加，可按照下式校正： F=F284 一 KF232 一 Fo 式中，F284为在波长284nm处对混合未知液测得的同步荧光信号；Fo为空白 溶液在284nm处产生的同步荧光信号；F为混和未知液中真正由色氨酸在 284nm 处产生的同步荧光信号；而K为在284nm与232nm同步荧光信号的比值，可由 单组分酪氨酸求

7、得，F232为混和未知液中酪氨酸在232nm处的同步荧光信号。由 F值从色氨酸工作曲线可确定混和未知液中色氨酸的含量。为什么？ 富而不骄，莫若富而好礼。”如今我们不缺 富不贵只能是土豪，你可以一夜暴富，但是贵气却需要三代以上的培养。孔子说 土豪，但是我们缺少贵族。 高贵是大庇天下寒士俱欢颜的豪气与悲悯之怀，高贵是位卑未敢忘忧国的壮志与担当之志高贵是先天下之忧而忧的责任之心。 精神的财富和高贵的内心最能养成性格的高贵，以贵为美，在不知不觉中营造出和气的氛围；以贵为高，在潜移默化中提升我们的素质。以贵为尊，在创造了大量物质财富的同时，精神 也提升一个境界。 一个心灵高贵的人举手投足间都会透露出优雅的品质，一个道德高贵的社会大街小巷都会留露出和谐的温馨，一个气节高贵的民族一定是让人尊崇膜拜的民族。别让富而不贵成为永久的 痛。 分享一段网上流传着改变内心的风水的方法，让我们的内心高贵起来： 喜欢付出，福报就越来越多；喜欢