抗除草剂Bar基因的优化及PAT蛋白的表达

1、抗除草剂Bar基因的优化及PAT蛋白的表达 DOI：10.14088/jki.issn0439-8114.2015.10.058 Bar 基因作为筛选标记基因，具有快速、简便、高效、转化 细胞产生的假阳性个体少等优点， 被广泛应用于转基因玉米 (Zea maysL.)、大豆(Glycine maX)、油菜(Brassica campestris L. )、水稻( Oryza sativa L. )、小麦( Triticum aestivum Linn. ) 和大麦(Hordeumvulgare L.)植物基因工程研究中1-3。Bar 基因编码膦丝菌素乙酰转移酶(PAT，其能够使草丁膦的有效 成

2、分一一膦丝菌素(PPT失活，从而解除除草剂的毒性。 Bar 基因广泛应用于基因工程育种中的抗除草剂基因， 也是遗传转化 中的标记基因 4 。目前，生物技术育种的阳性转化体筛选多数 依据 Bar 基因表达的草丁膦除草剂耐受性进行表型鉴定筛选。 而 由于其不同时代单个转化体的外源基因表达稳定性未知， 表型筛 选易受环境等因素影响， 导致了鉴定准确性不高。 转基因植物标 记基因的检测方法主要有表型鉴定、PCR鉴定、ELISA和Western 印迹等方法5。ELISA分析法特异性高，获得结果快，仪器操 作简单，同时可降低检测成本 6-8 。建立 Bar 基因原核表达体 系，表达和纯化PAT蛋白质可为转

3、基因转化外源蛋白质提供参 考，本研究通过密码子优化和全基因合成， 获得了适合原核表达 的Bar基因片段，并分离纯化得到的高纯度 PAT蛋白质，可作为 抗原为制备多抗和单抗打下基础。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌株与质粒 原核表达载体 pET28a (+)、大肠杆菌 (Escherichia coli ) BL21 (DE3和大肠杆菌 DH5况由吉林省 农业科学院生物技术研究所转基因安全评价室保存。 1.1.2酶及试剂限制性内切酶、T4 DNA连接酶、DNA聚合 酶、dNTPs引物Marker购自宝生物工程(大连) XX公司；氨 苄青霉素、卡那霉素、IPTG十二烷基磺酸钠(SDS

4、和B -巯 基乙醇购自Promega公司；Ni-NTA His Bi nd Res in 、层析柱购 自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。 1.2 方法 1.2.1克隆基因片段 以合成引物PCF扩增Bar基因全长， 然后用BamH I和Hi nd山内切酶分别酶切 pET-28a载体和扩增 片段，将扩增片段连接pET-28a载体，连接产物转化至DH5况感 受态细胞。利用PCR扩增鉴定阳性质粒，并将阳性重组质粒命名 为pET-Bar。提取质粒pET-Bar并转化到BL21 (DE3感受态细 胞。挑取含pET-Bar质粒的单克隆菌落，接种于 100 mL含有氨 苄青霉素的LB培养基中，37 C振荡培

5、养过夜。次日用LB(Amp+ 稀释至1 000 mL 37 C培养至 OD600nm为1.0左右，力口 IPTG至 终浓度为1 mol/L。37 C继续培养6 h后4 C、5 000 r/min 离 心10 min，收集沉淀并用PBS洗涤。 1.2.2 密码子的优化 利用 SignalP 3.0 Server 软件预测 Bar 基因序列有无信号肽及其位置；利用 TargetP 1.1Server 软 件检测此信号肽的功能。 将链霉菌中 Bar 基因密码子与大肠杆菌 偏好密码子进行比对， 根据密码子的兼并性， 将 Bar 基因密码子 改造为大肠杆菌偏好密码子。 1.2.3 表达载体的构建 将含有

6、目的基因的片段切下并用胶 回收试剂盒回收，再与同样酶切处理的载体pET28a连接，并转 化大肠杆菌DH5x，碱解法提取质粒，根据酶切鉴定结果，筛选 含有Bar基因的重组质粒命名为 pET28a-Bar。摇菌过夜培养， 取1 mL菌液送北京鼎国昌盛生物技术公司测序以确定基因序列。 1.2.4 外源基因的诱导表达 将含有 pET28a-Bar 表达载体 的BL21 (DE3菌株于37 C活化过夜后，按4： 100稀释到20 mL含有60 mg/mL卡那霉素的LB培养基中。振荡培养至OD600nm 为0.61.0时，加入IPTG至终浓度为0.6 mmol/L，再继续培 养 3 h 后 12 000

7、r/min 离心 5 min 后收集菌体，用 0.025 mol/L Tris-HCl (pH 8.0 )重悬菌体， 12 000 r/min 离心 2 min 收集 菌体，置于-20 C备用。 1.2.5诱导表达条件的优化 振荡培养至OD600 nm为0.6 时，加入IPTG后2 h、5 h、过夜诱导，分别取出1 mL菌液， 12 000 r/min 离心1 min收集菌体，菌体置于-20 C备用。以 SDS-PAGE分析不同的表达时间对蛋白质诱导表达量的影响。菌 液振荡培养至OD600 nm为0.6时，加入IPTG至终浓度分别为1 mmol/L，分别在37 C继续诱导5 h以上，其中在每隔

8、1 h均取 出 1 mL 菌液， 12 000 r/min 离心 1 min 收集菌体，用 SDS-PAGE 电泳分析最佳诱导表达时间。 126目的蛋白质的纯化 取诱导表达3 h后的菌液，4 C、 6 000 r/min 离心 20 min 收集菌体，将菌体破碎后分别收集可 溶性和包涵体表达的PAT蛋白质，利用镍离子亲和层析柱纯化， 可溶性表达的PAT蛋白质在非变性条件下纯化，包涵体形式的 PAT蛋白质在变性条件下纯化。2结果与分析 2.1 密码子的优化 利用 SignalP 3.0 Server软件预测 Bar 基因序列有无信号 肽及其位置；利用 TargetP 1.1Server 软件检测

9、此信号肽的功能。 将链霉菌中 Bar 基因密码子与大肠杆菌偏好密码子进行比对， 根 据密码子的兼并性将 Bar 基因密码子改造为大肠杆菌偏好密码 子（图 1）。 2.2 优化序列合成 序列确定后在基因的5端引入BamHI酶切位点，3端引 入Hind山酶切位点，并加入保护碱基进行全基因合成。扩增Bar 基因全长的引物： BarF：5 -CGCGGATCCATGTCTC3CG；- BarR： 5 -CCCAA GCTTGATTTCGGTAAC-分别用前 114条和1326条引 物进行PCF扩增，把两次扩增后的产物各取1卩L做模板，用 BarF和BarR引物进行基因全长扩增，PCF扩增产物见图3。测

10、 序结果表明， 优化前后核苷酸序列同源性为 79.89%，氨基酸（183 个）同源性为 100%。 2.3 pET28a-Bar 表达载体的构建 将Bar基因片段和pET28a载体以BamH和Hi nd山双酶切 后，T4 DNA连接酶连接过夜，转化到大肠杆菌 DH5x中，然后 将阳性质粒pET28a-Bar转化到大肠杆菌BL21（ DE3中，表达 质粒 pET28a-Bar 酶切鉴定结果见图 4。 2.4 Bar 基因的原核表达诱导 挑取含有重组阳性质粒的单菌落，接种到含有100 mg/mL氨 苄青霉素的LB液体培养基中，37 C振荡培养过夜，然后1 : 100 接种于含有氨苄青霉素 LB液体培养基中，OD60Chm为0.40.6 时加入I