考马斯亮蓝测蛋白实验报告

1、实验二：分光光度计的学习之考马斯亮蓝G-250法 (Bradford法)测定蛋白质含量定 一实验目的 学习分光光度讣的基本原理和使用方法，并使用考马斯亮蓝G-250法测定蛋口质 含量。 二实验原理 考马斯亮蓝G-250 (Coomassie brilliant blue G-250)测定蛋白质含量属于染 料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm； 当它与蛋白质结合后变为青色，蛋口质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸 收。其光吸收值与蛋口质含量成正比，因此可用于蛋口质的定量测定。蛋白质与 考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应

2、十分迅速；其 结合物在室温下lh内保持稳定。该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单, 操作简便快捷，反应非常灵敏，灵墩度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋 白质含量，测定蛋白质浓度范用为01 000 ug/mL,是一种常用的微量蛋白质 快速测定方法。 三实验材料 1. 实验材料：未知浓度的牛血清样品 2. 主要仪器：试管、移液枪、分光光度计等。 3. 试剂：蛋白试剂考马斯亮蓝G-250的配制：称取lOOmg考马斯亮蓝G-250, 溶于50mL90%乙醇中，加入85% (W/V)的磷酸1 OOmL,最后用蒸镭水定容到1 OOOmL。此溶液在常温下可放置一个月。 四实验步骤 标准曲

3、线制作：取6支10mL干净的试管，按表1取样。摇匀后放置加in ,用 lcm光经的比色杯在595nm波长下比色，记录测定的光密度0D595nm,并做标准 曲线。 表1低浓度标准曲线制作 管号 0 1 2 3 4 5 lmg/ml标准蛋白(ml) 0 0. 02 0. 04 0. 06 0. 08 0. 10 蒸馆水(ml) 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 考马斯亮蓝G-250 (ml) 5 5 5 5 5 5 蛋白浓度(mg /ml) 0 0. 02 0. 01 0. 06 0. 08 0. 10 OD595nzi 0 0. 339 0. 191 0. 601 0. 775 0.

4、799 拟合标准方程：y二7.7329x+0. 1142 2. 未知蛋白质浓度的测定 另取2支10mL试管，按下表取样。吸取测定液0. ImL,蒸谓水0. 9 mL放入试 管中，加入5mL考马斯亮蓝G-250蛋口试剂，充分混合，放置2min后用lcm光 径比色杯在595nm下比色，记录光密度0D595nm,并通过标准曲线查得待测品提 取液中蛋白质的含量X ( ug) o以标准曲线0号试管做空白。 五实验结果 待测样品的吸光度1为0.240,待测样品的吸光度2为0.266,平均值为0.253。 代入标准曲线得知x为0. 0018,所以浓度为0. 018 mg /ml。 六、实验分析 经测量得每毫升测定液中蛋口质的含量很低，是样品本身蛋白含量少还是 实验操作造成，还需进一步分析。 注：文档可能无法思考全面，请浏览后下载，供参考。 （二）考马斯壳蓝法测定未知蛋白浓度： 优点：1、灵敏度高； 2、测定快速、简便，只需要加入一种试剂； 3、干扰物质少。 缺点：一般分光光度法都有较大的机器误差（重复性较差），为了数据准确，需 要每次进行标准曲线的测定。 七、注意事项 1 在测量前应把分光光度计预热半小时，打开开关时，先确定开关按钮的置，切 不可凭直觉乱摸。 2称量样品前，电子天平要归零，称量时要精准。 3. 溶液一定要配制准确，以防影响实验效果，保证点在一条直线上。 4.