His蛋白纯化原理方法和问题分析

1、His蛋白纯化原理方法 和问题分析 Hessen was revised in January 2021 组氨酸（His）标签蛋白的纯化 His-Tag融合蛋口是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表 达方便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体 都可以用固定金属离子亲和色谱（IMAC）纯化。 IN!AC（Immobilized Metal-ion affinity chromatography）ft Porath et 年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、银、钻或锌离子，可以吸附纯 化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋口，1987年Smith et

2、 al.发现 带有儿个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25作用力更 强，此询在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25亲和纯化在氨 基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年1987年Hochuli et dl.发现带有相 连组氨酸的多肽和Ni2+-XTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用 这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一 次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋口配合IMAC变得 非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨 酸标签的蛋口配合IMAC纯

3、化变成最常用而且最有效的研究蛋口结构和功能的有 力手段。1986年Porath et al.还发现Fe3+-IDA-sephadex G25可以用于磷酸 化蛋口的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子 的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和 金属离子结合的多肽，应用非常广泛。 Ni柱中的氯化謀可以与有His （组蛋白）标签的蛋白结合，也可以与咪哇结合。 步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化線，一个柱长体枳就行 T.然后平衡柱子，拿你自己的buffer,给蛋白提供最适的环境，我一般平衡4个柱长， 然后蛋白上样，你

4、可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加个 恒流泵，但是一左不能太快，太快挂柱效果差，当然你也可以选择循环挂柱，就是恒流泵 的一头接你装蛋白的烧杯，从柱子中留下来的液体还用冋一个烧杯接回去。挂完之后，按 理想来讲，你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了，杂蛋白多数在烧杯里，留下来了，当然肯 左有少量杂蛋白也挂上了，这时候你要，拿咪哇和你的buffer配，一般从0 20mM 40mM。100mM这样洗脱（当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候）我指的 是咪呼的终浓度。咪卩坐加入之后，会和蛋白争夺与Ni的结合位点，杂蛋白、你的目的蛋 白，会在不同的浓度被洗脱下来，洗完之后，你可以

5、用400mM咪哇洗柱子，淸理一切蛋 白，然后平衡几次，是否选择重生你自己泄咯然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯过的 蛋白用不同的管子收下，然后SDS-page检测在哪个管子里。 市面常见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签蛋口的配基有以下儿种： 一、组氨 （His）标签蛋白的纯化步 大肠杆菌的破碎方法： 1）收集培养发酵液，4度7000-8000g离心10分钟，收集沉淀的菌体（如果不 是马上破碎可以放-70度冷冻，但是最好能保存成小块或者薄片，这样好用。） 2）取1-2克菌体加10ml破碎缓冲液（的50mM磷酸缓冲液含NaCl, ml溶菌 酶，ImM PMSF, ImM MgC12, ml B

6、enzonase,其中的菌酶，ImM PMSF, ml Benzonase现加）在冰上混合45分钟，如果pH不在7-8,需要用NaOH -边搅 拌一边滴加如果溶菌酶10mg/ml混合时间可以缩短到10分钟. 3）把混合菌体在冰水中用超声探头破碎20秒种，总共四次，中间间隔要保持2 分钟冷却破碎液，检测pH,如果不在7-&还是用NaOH 一边搅拌一边滴加去调. 如果菌体的为50-500克,可以高压破碎的方法，缓冲液同上，体积为1升,破碎三 次,压力为800 bar. 4）破碎的液4度12000g离心10分钟，如果要让溶液更澄清，可以4度 50000g离心30分钟，这时候可以把上清和沉淀分别留样，

7、跑电泳，如果只沉 淀中有口标蛋白，那就用变性条件下去提取。 1. 大肠杆菌的破碎离心的上清加2M咪醴溶液使终浓度为20mM,样品的总体积 为 10mlo 2. 过柱子的样品最好过um的滤膜，避免堵柱。 3. 可溶性蛋白的纯化： 1）平衡缓冲液：的50mM磷酸缓冲液含NaCl,含20mM咪醴。 2）洗脱缓冲液：的50mM磷酸缓冲液含NaCl,含500mM咪醴。 3）取1ml線琼脂糖凝胶FF或線NTA琼脂糖凝胶FF预装柱，用10ml平衡缓冲 液平衡，然后取破碎上清10ml样品以min样，然后2ml/管分管收集。 4）用15ml平衡缓冲液洗去未吸附的样品，流速l-2ml/min, 2ml/管收集。

8、5）用5 ml洗脱缓冲液洗去未吸附的样品，流速l-2ml/min, 2ml/管收集。 6）再用5ml平衡缓冲液平衡柱子，灌满20%乙醇，封闭，以备下次使用。 7）此方法是通用的方法，但是未必能得到适合自己蛋白的满意效果，所以优 化的办法是洗脱可以用50mM, lOOmM, 300mM, 500mM分阶段洗脱，各洗脱5个 柱体积，这样配合电泳检测，得到适合自己的蛋白的条件。 8）收集的部分可以用紫外分光光度法、BCA法或用考玛斯亮蓝法测定蛋口的 浓度，再取有蛋口的部分电泳检测纯度。 二、常见问题及解决方法 1 不溶解或沉淀在柱子上：要留意缓冲液体的pH,此外在样品中添加一些表面 活性剂其至乙醇等

9、有机溶剂可以增加疏水性蛋白的溶解度，对于带半胱氨酸多 的蛋白很容易氧化聚集沉淀，所以需要加2-5mM疏基乙醇避免沉淀。 2白不吸附：这是最常见的，通常的原因有：1是标签不暴露，被折叠在蛋口 的结构内，可以在变性的条件下去纯化，如果用服变性吸附不好，可以改用盐 酸弧，个人经验是这样通常可以使吸附不上的蛋白得到改善，顺利纯化。2可 以选择作用力更强，配基密度更高的填料，通常線琼脂糖凝胶作用力最强，如 果蛋白分子量大可以选择手臂长的填料，如線TA琼脂糖凝胶，填料的好坏可 以看填料的颜色，颜色越深那配基密度越高，作用力也相应要强。3样品的pH 过低或者沉淀导致不能吸附，所以样品和缓冲液的pH要尽量一致

10、，避免沉淀， 通常再偏碱性条件下吸附更好。 3难洗脱：如果穿透中U标蛋1明显减少，而洗脱乂没有，取点填料加电泳缓 冲液煮后离心跑电泳还是有H标蛋白，可以用更强的洗脱条件如500mM咪醴， 如果还不能洗脱，可以直接用500mM咪醴加到6M盐酸弧去洗脱。 4. 电泳杂带多：因为这种亲和毕竟特异性要差点，原因在蛋白中带组氨酸，色 氨酸，半胱氨酸等很常见，特别是蛋白折叠会导致儿个这样的氨基酸残基临 近，这样也会使它们和银柱的作用力增加，因此可以用不同浓度的咪醴阶段洗 脱，此外在咪醴洗脱前增加一步PH3的酷酸缓冲液洗脱，在平衡缓冲液中添 加吐温或Triton可以避免因为疏水相互作用导致非特异吸附，这样可

11、以电泳 的杂带明显减少，但是如果用这样的方法还是杂带多，那就地回头去看看破碎 的条件是不是太剧烈或者温度控制不好导致蛋白短裂或者分解导致一些蛋白片 段带标签，或者因为样品长时间保存导致水解等，总之纯化的好坏决定于每一 个步骤，不仅仅是纯化的问题。还有一个不容忽略的问题是有时候因为蛋白相 互作用或者因为形成聚合体导致杂带增加，而山于疏水相互作用或者因为离子 作用可以通过添加表面活性剂或者增加离子强度得到改善，对于因为形成聚合 体的可以在缓冲液和样品中加l-2mM硫基乙醇避免，如果这样的情况下最好是 选择银TA琼脂糖凝胶，因为它在还原剂下更稳定。 三、影响IMAC纯化结果的因素 1.填料的种类：

12、不同填料厂家的填料有差别，所以使用过程最好能得到厂家的技术支持，因为 不同的厂家填料不同，此外蛋白纯化个性很强，没有哪一个填料是能适合所有 带六个组氨酸标签蛋白的纯化，载量高和特异性好本身就是矛盾。 2填料的配基种类、密度、金属离子种类 填料最简单的判断是螯合好同样的金属离子，哪家产品的颜色越深就意味着和 蛋tl的作用力越强，适用范围越广，载量也越高，纯化的好坏关键看纯化的条 件，仅有填料的特异性是不够的，同样配基密度下IDA填料的亲和力要比TA 的强，所以NTA上不能吸附的样品可以选择IDA为配基的填料。 3螯合金属离子和蛋白作用强弱为铜和银离子的强，而锌和钻离子的弱。因此 如果一个蛋白作用力强，想得到好的特异性可以选择螯合钻离子，它还有一个 优点是不怕还原剂，特别时候有高浓度的还原剂。相同金属离子，IDA的强于 NTAo螯合金属离子的价位越低和蛋白的作用力越强。同时银离子是最常用的, 如果有条件可以换不同金属离子以得到更好的效果，因为不同的金属离子有不 同的选择性。因此要希望填料应用范围广就选择银琼脂糖凝胶，如果是希望特 异性好