烷化剂对野生型和缺陷型Ames试验菌株DNA修复的剂量效应的定量评价(20210517223428)

1、烷化剂对野生型和缺陷型Ames试验菌株DNA修复的剂量效应的定 量评估容细胞暴露在DNA破坏因子前，可能会通过碱基直接错配或间接 修 复过程，导致基因突变和染色体断裂，引发潜在DNA通过错误的造 成各种不同类型的预诱变DNA性的恶变。烷化剂可通过共价修饰46 分别和胸腺卩密唳和鸟卩票吟的错配结果。00损害，例如-MeT-MeG和 尤其进行了一系列烷化剂诱变作用的定性和定量的研究。在近几年, 是一些化合物，像乙基甲磺酸盐、甲基甲磺酸盐和乙基亚硝基麻，不 其诱变实验结果显示诱变量并未超过自然突变管是在体外还是在体, 下达到的剂量水平。这使人们尝试去用定量的方法取代定性的“是或 不是”来定义剂量效应

2、关系。其他基因毒性的耐药性研究结果显示, 所观察到的临界值是DNA修复酶的活性（例如碱基切除修复酶、烷 基转移酶）和抗氧化应激的保护机制的主要促成因素。烷基转移酶可 以高保真修复预诱变加成物并在监测基因组完整性中起到决定性作 用。在鼠伤寒沙门氏杆菌中存在两种烷基转移酶机制，一种是组成型 “鸟卩票吟转移酶，0gt）;DNA烷基转移酶（O另一表达0-烷基鸟卩票吟 6烷基鸟卩票吟转移酶I （Ada,即适应性响应）。种是可诱导的O在鼠伤寒沙门氏杆菌中，Ogt机制在大多数DNA修复烷基化病变的活动中 起主要作用。然而，研究结果表示，烷化剂对Add蛋白的表达有 微 $.弱的诱导作用。Yamada发现，Am

3、es测试菌株缺少甲基转移酶，变成 对诱变烷化剂高度敏感的菌株。近几年来，Goeke计算出鼠伤寒沙门 氏杆菌，在EMS处理下，烷基转移酶对DNA病变处的修复速率。计算出的修复率值约为100%的剂量水平低于所观察到的阈值。这表 明无误差的DNA修复是烷化剂阈值诱导作用的主要机制。为定量确 定烷基转移酶对烷化剂的致突变性，在一系列的Ames试验中，我们 研究了紧密间隔的剂量水平的乙基甲磺酸盐（EMS）,甲基磺酸甲酯 （MMS）,乙基亚硝基腺（ENU）,甲基亚硝基腺（MNU）,替莫卩坐胺（TMZ）。众所周知，这些化合物可诱导不同形式的DNA加合6-0 鸟卩票吟、MMS诱导物。现己证明，在哺乳动物细胞中

4、，用EMS6-G） 烷基化加合物时，浓度比较低只有2%至（03%的EMS和0.3%6-G加合物可以被MNU （5%-MMSo然而，更高浓度的011%）和6-G被至12% OENU17%）诱导。在细菌中，除非是在9%ENU （9% -6-G加合物是检测不到的。不同MMS诱导的0处理后检测，否则被 于EMS, MMS, ENU和MNU直接使DNA烷基化，TMZ则是通过 自发水解形成高活性的阳离子甲基重盐，这导致DNA在不同的位置 6-MEGo 0甲基化，包括诱变损伤处的DNA修复使用的野生型和缺 陷型 Ames 试验菌株，包fS TA1535 （Ogt+/Ada+）, YG7100 （Ogt+ /

5、Ada-）, YG7104 （Ogt-/Ada+）和 YG7108 （Ogt-/Ada-）o 值得注意 的是，TA1535核苛酸切除修复（NER）是不充分的，因此来源于 TA1535包括 YG7100,YG7104和YG7108菌株NER也是不充分的。 利用统计软件包在自由软件环境下的“R” $.下确定一个出发点（POD）对结果进行了分析：由沃纳和罗马卢茨创 建的曲棍球棒模型，这将被指定在以下由Wout Slob改进的“Lutz Lutz”和被称为PROAST的基准剂量模型中。结论ogt-缺陷株对烷化剂更敏感为了检验两种烷基转移酶Ogt和Ada的诱导突变在剂量反应关系上 的影响，分析了五种烷化

6、剂，包括两种磺酸盐（EMS, MMS）,两种 亚硝基化合物（ENU,MMU）和替莫卩坐胺，烷基转移酶野生型（TA1535, Ogt+/Ada+）和烷基转移酶缺陷型（YG7104, Ogt-/Ada+； YG7100, Ogt+/Ada-； YG7108, Ogt-/ Ada+）沙门氏测试菌株。一系列的 22 个紧密间隔的浓度能确保剂量-响应曲线非常精确，特别是在低剂量 区。由于应变敏感性差异，TA1535, YG7100最高浓度高达5000 U g/板，而YG7104和YG7108则是低10倍的浓度。组氨酸回复突变 每板的平均值在图表上1A-1E之间。为了呈现的整个剂量围，数据 都出现在双对数

7、表（对数）中。总的来说，现己观察到Ogt缺陷型菌 株比野生型菌株更敏感，而Ada的影响似乎要小的多。EMS和ENU 剂量效应曲线几乎是相同的，而且与Ada的状态没有关联。相反，MMS和TMZ,其剂量效应曲线类似，缺乏Ogt和Ada的细菌比那些 只含Ogt的试验菌株要敏感十倍。在MNU诱变实验中观察到了类似 的结果。在TA1535菌株中，只有在EMS和MMS分别为2000 n g/ 板和400 ug/板的浓度时，诱导突变体的频率2100回复突变体/板， 而用浓度为100 n g/板的MNU和ENU处理时，会诱导出大量的回 复S.突变体。有趣的是，如图2a和2b所示，在菌YG7108(Ogt-/A

8、da-) 中，MMS和EMS 1毫克/板的浓度能够诱导100个回变菌落数，而 对MNU和ENU来说，浓度分别约2.5 n g/板和7.5ug/板，才能诱 导YG7108类似的突变频率。这似乎与下面要讲的亚硝基化合物具 有较强诱变能力的概念相矛盾。TA1535(Ogt+ / Ada+)的阈值可以确定，但YG7108(Ogt/ Ada)的不 能确定。对菌株 TA1535 (Ogt+/Ada+)和 YG7108 (Ogt-/Ada-)所描述的 统计模型进行剂量效应曲线拟合。由于达到平衡或诱导毒性降低会扰 乱统计建模，只有在被选中的亚致死剂量围，效应能力才会随着浓度 的增加而增强。(EMS： TA15

9、35 在 0 - 3359ug/板，YG7408 在 0 - 8.35 u g/板；MMS： TA1535 在 0 - 5000 u g/板，YG7108 在 0 - 3.5 ug/板；TM乙 TA1535 在 0-2125ug/板，YG7108 在 0-1.85 ug/ 板；ENU： TA1535 在 0-336ug/板，YG7108 在 0-25吒/板；MNU： TA1535 在 0 170ug/板，YG7108 在 0 - 30 u g/板）。女口图 3所示，在TA1535中，所有测试的化合物的阈值都在远离零的较低 的 LutzLutz模型可靠区间（Td丄）。在这一菌株，发现EMS阈值使

10、最高的（1145ug/板），其次是MMS, TMZ （分别为8仃和729 ug/板，） 和ENU, MNU （分别为136、125 ug/板，见表一）。值得注意的 是，首先是MNU,在TA1535中观察到的剂量-效应曲线平直段阈 值达到（125ug/板）水平，紧接着就是在阈值剂量处有了一个急转 弯。相比之下，在YG7108中，所有测试的化合物在Lutz Lutz模型 中都$.是线性剂量效应曲线，除了 MNU和TM乙 经计算，它们的阈值非常 的低（分别为2.8和0.16 ug/板）。因此 可以做出一个合理的假设， 所观察到的阈值起因于甲基转移酶Ogt和Ada有效无误地去除小的 64烷基T。在TA

11、1535中，烷基G和0由烷基加合物如OLutz丄utz 模型计算出亚硝基化合物的阈值比磺酸盐的阈值低得多。在YG7108 中，尽管测出的四个化合物的剂量水平非常低，但并不能排除它们， 因为通过EMS, MMS,与ENU测试更低的浓度，己能检测到很小 但是可以计量的阈值。在TA1535和YG7108中，利用BMD （基准剂量）计算出的剂量效 应曲线见图4。BMD计算出的d值（在此处指出了不合理的地方， 见研究方法部分）也和表一总结的一样。与Lutz丄utz模型一致，在Tds非零处只存在TA1535 （除了用MNU处理的YG7108）,在TA1535测出的烷化剂d值和BMD值一般高于在YG7108

12、中所测值。 在TA1535中，观察到MMS, EMS和TMZ的BMD最高值（分别 为 953, 831,和 858 u g/板），MNU, ENU （分别为 78 和 51 ug/ 板）（表）。有趣的是在YG7108中，MNU的BMD值（2.4mg/板） 显著高于其他所有化合物，这表明Ogt菌株对MNU的耐药性比较低（YG7104和YG7108）,与其他化合物中是不同的。讨论：在鼠伤寒沙门氏菌中，Ogt是组成型表达，而Ada则是只在有限的围 可诱导。因为所有的沙门氏菌菌株都是NER缺陷型，因而清除烷基 化病变的主要是Ogt。Goeke等人根据EMS的浓度计算出 了 .S.Ogt修复DNA损你无

13、差错）的成功率。总乙Ames测试菌株TA1535（Ogt+/Ada+）和丫G7104 （Ogt-/Ada+）经 EMS 处理后的剂量效 应曲线，是由Goeke等人使用基准剂量模型进行拟合（PROAST） 的。通过比较两种在不同的EMS浓度下由Ogt系统无错误修复的菌 株，可预估到结果。作者的结论是随着EMS浓度降低错误的修复率 接近于零。在我们目前的研究中，己经扩大到四种烷化剂，ENU, MMS, MNU和TMZ,但主要集中在评估剂量反应关系对DNA修复 的影响。不同化合物的诱变效力是通过比较它们的PoDs来进行评估, 这是通过曲棍球棒或阈值（TD）模型和基准剂量（BMD）的方法计 算的。Og

14、t缺乏时，Ada有选择的修复甲基化DNA但不修复乙基化DNA 与亲木菌株TA1535 (Ogt+/Ada+)相比，只含有Ogt缺乏Ada的菌 株，它的敏感性并没有显著改变。这细微的差异可能是由于生物变异。 然而，在没有Ogt鼠伤寒沙门氏菌中，同样也缺乏Ada (YG7108, Ogt-/Ada-比那些含有 Ada 的菌株(YG7104, Ogt-/Ada+)对甲基化(MMS,MNU,TMZ)更为敏感。这与山田等人1997 得出的结果一致，这表明比起乙基化加合物，Ada会优先修复甲基化 66-MeTo此外，在OgtO缺乏，用乙基加合物，如O加合MeG和 物和甲基加合物处理后，Ada对甲基加合物的

15、特异性，可能会更明 显。对这些加合物的含量与分布的进一步研究将有助于阐明我们观察 到的诱变差异研究。亚硝基腺类的阈值在TA1535中比烷基磺酸盐的阈值低，但在S.YG7108中其阈值却比烷基磺酸盐的阈值高。6-G 一般其诱导的高度突变的O 烷基磺酸盐与亚硝基化合物相比, 6G加合物百分比：ENU MNU EMS MMS加合物较少(O)。与我们的实验相符的是，在TA1535中这两种磺酸盐(EMS、MMS) TD值均高于亚硝基化合物(ENU, MNU)的TD值。在大鼠Pig-a 基因突变的研究中，EMS对红细胞CD592突变体诱导阈值为 22mg/kg/dayo同样，转基因小鼠研究表明EMS的剂量

16、在每日低于 25mg/kg/day （骨髓和胃肠道）和50mg/kg/day （肝）时LacZ基因 突变是不可诱导的。在最近我们的Pig-a研究证实，红细胞CD592 突变体的经MMS诱导的阈值为8mg/kg/day。相反,在Pig-a实验中， 两种亚硝基腺类化合物 ENU（0.9mg/kg/day）和 MNU（2.5mg/kg/day） 的阈值则很低。在丫G7108中，EMS, MMS,与ENU的Tds值不可计算，只能计算出MNU的TD值为2.8ug/板。此外，磺酸盐EMS和MMS 的BMD值均低于相应的亚硝基化合物ENU和MNUBMD值。这些 结果表明，磺酸盐在双缺失菌株中比亚硝基化合物更

17、有效，其比亚硝 基化合物对野生型细菌具有更高的致突变性。意想不到的是，在 YG7108菌株中，磺酸盐具有较强的诱变效应，剂量与高度诱变的 GO加合物的相对频率无关。这让我们假设，在双野生型菌株中， 其他DNA加合物可能会促成突变效应。N7鸟瞟吟加合物（N7G） 6-G0加合物更高的水平（最高的经烷化剂处理后被诱导达到比MMS, 即85%左右，最低的ENU,即在哺乳动物细胞中15%）o .5.G加合物的诱变少得多。N7-G加合物诱变比O然而，人们通常认 为此外，在双缺失株（YG7108）中，磺酸盐的相对效力也恢复了。 虽然在双野生型菌株（TA1535）中，计算出EMS、MMS的PoD值 非常相似（EMS的TD值略高于MMS的，但两种化合物的BMD值 几乎相同），在双缺失株（YG7108）中，计算出MMS的BMD值（0.07ug/板)大大低于EMS (0.32 ug/板)的BMD值。然而，对于亚硝 基化合物来说，ENU的PoD值始终低于MNU的PoD值。负责效 力逆