第八章非水酶催化(1)

1、第8章：酶的非水相催化 enzymatic catalysis in non-aqueous system contents of chapter 8 1、酶非水相催化反应的研究概况 2、水对非水相介质中酶催化的影响 3、酶在有机介质中的催化特性 4、有机介质中酶催化反应的条件及其控制 go go go go 5、酶非水相催化的应用 go 第一节酶非水相催化反应的研究概况 水是酶促反应最常用的反应介质。水是酶促反应最常用的反应介质。 但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为但对于大多数有机化合物来说，水并不是一种适宜的溶剂。因为 许多有机化合物许多有机化合物(底物底物)在水介质

2、中难溶或不溶。在水介质中难溶或不溶。 由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反由于水的存在，往往有利于如水解、消旋化、聚合和分解等副反 应的发生。应的发生。 是否存在非水介质能保证酶催化？是否存在非水介质能保证酶催化？ 1984年，克利巴诺夫（年，克利巴诺夫（klibanov）等人在有机介质中进行了酶催化反）等人在有机介质中进行了酶催化反 应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽应的研究，他们成功地在利用酶有机介质中的催化作用，获得酯类、肽 类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶剂的互溶类、手性醇等多种有机化合物，明确指出酶可以在水与有机溶

3、剂的互溶 体系中进行催化反应体系中进行催化反应。 klibanov 的实验 酶非水相催化的几种类型酶非水相催化的几种类型 有机介质中的酶催化有机介质中的酶催化 有机介质中的酶催化是指酶在含有一 定量水的有机溶剂中进行的催化反应。 适用于底物、产物两者或其中之一为 疏水性物质的酶催化作用。酶在有机 介质中由于能够基本保持其完整的结 构和活性中心的空间构象，所以能够 发挥其催化功能。 气相介质中的酶催化气相介质中的酶催化 酶在气相介质中进行的催化反应。适 用于底物是气体或者能够转化为气体的 物质的酶催化反应。 由于气体介质的 密度低，扩散容易，因此酶在气相中的 催化作用与在水溶液中的催化作用有明

4、显的不同特点。 l超临界介质中的酶催化超临界介质中的酶催化 酶在超临界流体中进行的催 化反应。超临界流体是指温 度和压力超过某物质超临界 点的流体。 l离子液介质中的酶催化离子液介质中的酶催化 l 酶在离子液中进行的催化作用。离子酶在离子液中进行的催化作用。离子 液（液（ionic liquids）是由有机阳离子与）是由有机阳离子与 有机（无机）阴离子构成的在室温条件有机（无机）阴离子构成的在室温条件 下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳下呈液态的低熔点盐类，挥发性低、稳 定性好。酶在离子液中的催化作用具有定性好。酶在离子液中的催化作用具有 良好的稳定性和区域选择性、立体选择良好的稳定性和区域选

5、择性、立体选择 性、键选择性等显著特点。性、键选择性等显著特点。 l热点热点：介质工程、溶剂工程介质工程、溶剂工程 l改变反应介质来改变酶催化反应的选择改变反应介质来改变酶催化反应的选择 性，从而达到人为的改变和控制酶的立性，从而达到人为的改变和控制酶的立 体专一性。体专一性。 有机相酶反应的优点：有机相酶反应的优点： l1 1 有利于疏水性底物的反应，能催化在水中不能进行有利于疏水性底物的反应，能催化在水中不能进行 的的 反应反应 l2 2 可提高酶的热稳定性可提高酶的热稳定性. . l3 3 可改变反应平衡移动方向可改变反应平衡移动方向 l4.4. 可控制底物专一性可控制底物专一性 l5.

6、 5. 酶和产物易于回收。酶和产物易于回收。 l6. 6. 可避免微生物污染。可避免微生物污染。 第二节：水和有机溶剂对非水相介质中酶第二节：水和有机溶剂对非水相介质中酶 催化的影响催化的影响 l不管采用何种有机介质反不管采用何种有机介质反 应体系，酶催化反应的介应体系，酶催化反应的介 质中都含有机溶剂和一定质中都含有机溶剂和一定 量的水。它们都对催化反量的水。它们都对催化反 应有显著的影响应有显著的影响。 一、 有机介质反应体系 l微水介质体系（研究最多，应用最广泛）微水介质体系（研究最多，应用最广泛） l用非极性有机溶剂取代所有的大量水，使固体酶悬浮在有机相中。但仍然含 有必需的结合水以保

7、持酶的催化活性(含水量一般小于2%)。 酶的状态可以是结晶态、冻干状态、沉淀状态，或者吸附在固体载体 表面上。 l与水互溶的有机溶剂与水互溶的有机溶剂组成的均一组成的均一体系体系 有机溶剂与水形成均匀的单相溶液体系。酶、底物和产物都能溶解在 这种体系中。 l与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系与水不溶性有机溶剂组成的两相或多相体系 由含有溶解酶的水相和一个非极性的有机溶剂(高脂溶性)相所组成的 两相体系。 l（正）胶束体系 胶束又称为正胶束或正胶团，是在大量水溶液中 含有少量与水不相溶的有机溶剂，加入表面活性 剂后形成的水包油的微小液滴。表面活性剂的极 性端朝外，非极性端朝内，有机溶剂包在液

8、滴内 部。反应时，酶在胶束外面的水溶液中，疏水性 的底物或产物在胶束内部。反应在胶束的两相界 面中进行。 l反胶束体系 又称反胶团，是指在大量与水不相混溶的 有机溶剂中，含有少量的水溶液，加入表面 活性剂后形成的油包水的微小液滴。表面活 性剂的极性端朝内，非极性端朝外，水溶液 包在胶束内部。反应时，酶分子在反胶束内 部的水溶液中，疏水性底物或产物在反胶束 外部，催化反应在两相的界面中进行。 反应体系对酶酯化反应的影响 反应体系含1-三甲基硅-1-乙醇10 mm，戊酸10 mm，内标正十五 烷， 脂肪酶50 mg，30，120 rpm条件下振荡反应 1：水饱和正已烷10 ml，2 ph7.2缓冲

9、液5 ml+正已烷10 ml 二、水对有机介质中酶催化的影响二、水对有机介质中酶催化的影响 l酶都溶于水，只有在一定量的水存在的条件下，酶分子才能进行催化 反应。所以酶在有机介质中进行催化反应时，水是不可缺少的成分水是不可缺少的成分之 一。有机介质中的水含量多少对酶的空间构象空间构象、酶的催化活性催化活性、酶的 稳定性稳定性、酶的催化反应速度催化反应速度等都有密切关系，水还与酶催化作用的底底 物和反应产物的溶解度物和反应产物的溶解度有关。 l酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。在无水的条 件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。故此，酶分子需要一层 水化层，以维持其完整的空间构象

10、。维持酶分子完整的空间构象所必维持酶分子完整的空间构象所必 需的最低水量称为必需水（需的最低水量称为必需水（essential wateressential water）。 l有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显著影响。存在最适水含量最适水含量 。 1、水对酶分子空间构象的影响、水对酶分子空间构象的影响 l l必需水：紧紧吸附在酶分子表面，维持酶催化 活性所必需的最少量水称为必需水。 l维持酶分子结构 中氢键、盐键等 副键所必需的。 l不同的酶，所要求的必需水的量差别很大。不同的酶，所要求的必需水的量差别很大。 在辛烷中糜蛋白酶催化仅需吸附在辛烷中糜蛋白酶催化仅需吸附50个水分子个水分子 ，

11、而脂肪酶仅需几个水分子就可显示出活性，而脂肪酶仅需几个水分子就可显示出活性 。 l同一种酶在不同有机溶剂中最适反应需水量同一种酶在不同有机溶剂中最适反应需水量 不同；溶剂疏水性越强，需水量越少。不同；溶剂疏水性越强，需水量越少。 l酶活最大时酶活最大时蛋白质结构的动力学刚蛋白质结构的动力学刚 性和热力学稳定性（柔性）之间达到最性和热力学稳定性（柔性）之间达到最 佳平衡点。佳平衡点。 l“刚柔并济刚柔并济” 2、水对酶促反应速度的影响、水对酶促反应速度的影响 l有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显 著的影响； l最适含水量：催化反应速度达到最大时的水 含量。 l在实际应用时应当根据实际情况。

12、3、水活度、水活度 l水活度（水活度（water activity)： l指特定的温度和压力条件下，反应体系中水的摩尔分数指特定的温度和压力条件下，反应体系中水的摩尔分数 xw 与水活度系数与水活度系数w的乘积：的乘积： w =w* xw l水活度系数水活度系数w是溶剂疏水性的函数，溶剂疏水性越大，是溶剂疏水性的函数，溶剂疏水性越大， w 越大。越大。 l w 是一个强质性质的物理量，在平衡状态时，反应体系中是一个强质性质的物理量，在平衡状态时，反应体系中 各组分（酶、溶剂、底物和产物）的各组分（酶、溶剂、底物和产物）的 w 是相同的。是相同的。 研究水活度的意义： l1 最佳水活度与溶剂的极

13、性几乎无关，大约在最佳水活度与溶剂的极性几乎无关，大约在0.55 左右左右 l2 可以排除溶剂对最适含水量的影响可以排除溶剂对最适含水量的影响 l3 水活度可由反应体系中水的蒸汽压除以在相同条水活度可由反应体系中水的蒸汽压除以在相同条 件下纯水的蒸汽压而测得。件下纯水的蒸汽压而测得。 二、反应体系中有机溶剂对酶催化反应的影响二、反应体系中有机溶剂对酶催化反应的影响 l常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈，常用的有机溶剂有辛烷，正己烷，苯，吡啶，季丁醇，丙醇，乙腈， 已酯，二氯甲烷等。已酯，二氯甲烷等。 l在水溶液中，酶分子均一地溶解于水溶液中，可以较好地保持其完整在水溶液

14、中，酶分子均一地溶解于水溶液中，可以较好地保持其完整 的空间结构。在有机溶剂中，酶分子不能直接溶解，而是悬浮在溶剂的空间结构。在有机溶剂中，酶分子不能直接溶解，而是悬浮在溶剂 中进行催化反应。中进行催化反应。根据酶分子的特性和有机溶剂的特性的不同，保持根据酶分子的特性和有机溶剂的特性的不同，保持 其空间结构完整性的情况也有所差别其空间结构完整性的情况也有所差别。 l极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分子的结合水，影极性较强的有机溶剂，如甲醇，乙醇等，会夺取酶分子的结合水，影 响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性, ,甚至引起酶的变甚

15、至引起酶的变 性失活。因此应选择好所使用的溶剂，控制好介质中的含水量，或者性失活。因此应选择好所使用的溶剂，控制好介质中的含水量，或者 经过酶分子修饰提高酶分子的亲水性，经过酶分子修饰提高酶分子的亲水性，避免酶在有机介质中因脱水作避免酶在有机介质中因脱水作 用而影响其催化活性用而影响其催化活性。 l有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响有机溶剂与水之间的极性不同，在反应过程中会影响底物和产物的分底物和产物的分 配配，从而影响酶的催化反应。，从而影响酶的催化反应。 本章 目录 第三节、酶在有机介质中的催化特性第三节、酶在有机介质中的催化特性 酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性

16、与水有很大差别，酶在有机介质中起催化作用时，由于有机溶剂的极性与水有很大差别， 对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影对酶的表面结构、活性中心的结合部位和底物性质都会产生一定的影 响，从而显示出与水相介质中不同的催化特性。响，从而显示出与水相介质中不同的催化特性。 l底物特异性底物特异性 l立体选择性立体选择性 l区域选择性区域选择性 l键选择性键选择性 l热稳定性热稳定性 底物特异性 l 酶在水溶液中进行催化反应时，具有高度的底物酶在水溶液中进行催化反应时，具有高度的底物 专一性，或称为底物特异性，是酶催化反应的显专一性，或称为底物特异性，是酶催化反应的显 著特点之一。

17、著特点之一。 l在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位 与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的与底物之间的结合状态发生某些变化，致使酶的 底物特异性会发生改变。底物特异性会发生改变。 l不同的有机溶剂具有不同的极性，所以在不同的不同的有机溶剂具有不同的极性，所以在不同的 有机介质中，酶的底物专一性也不一样。有机介质中，酶的底物专一性也不一样。 立体选择性 l酶的对映体选择性酶的对映体选择性(enantioselectivity)又称为立体选择性或又称为立体选择性或 立体异构专一性，是酶在对称的外消旋化合物中识别一种立体异构专一性，是酶在对称的外

18、消旋化合物中识别一种 异构体能力大小的指标。异构体能力大小的指标。 l酶立体选择性的强弱可以用立体选择系数酶立体选择性的强弱可以用立体选择系数(kld)的大小来衡的大小来衡 量。其值越大，表明酶催化的对映体选择性越强。量。其值越大，表明酶催化的对映体选择性越强。 l酶有机介质中催化，与酶在水溶液中催化相比，由于介质酶有机介质中催化，与酶在水溶液中催化相比，由于介质 的特性发生改变，而引起酶的对映体选择性也发生改变。的特性发生改变，而引起酶的对映体选择性也发生改变。 l酶在水溶液中催化的立体选择性较强，而在疏水性强的有酶在水溶液中催化的立体选择性较强，而在疏水性强的有 机介质中，酶的立体选择性较

19、差。（这点在手性药物的制机介质中，酶的立体选择性较差。（这点在手性药物的制 造中，有重要的应用）。造中，有重要的应用）。 区域选择性 l酶在有机介质中进行催化时，具有区域选择性（酶在有机介质中进行催化时，具有区域选择性（ regioselectivity),即酶能够选择底物分子中某一区域即酶能够选择底物分子中某一区域 的基团优先进行反应。的基团优先进行反应。 例如：例如： 脂肪酶催化脂肪酶催化1，4-二丁酰基二丁酰基-2-辛基苯与丁醇之间的转辛基苯与丁醇之间的转 酯反应，在甲苯介质中，酶优先作用于底物酯反应，在甲苯介质中，酶优先作用于底物c-4位位 上的酰基；而在乙腈介质中，酶优先作用于底物上

20、的酰基；而在乙腈介质中，酶优先作用于底物 c-1位上的酰基。位上的酰基。 键选择性 l同一个底物分子中有种以上的化学键都可以与酶反应时同一个底物分子中有种以上的化学键都可以与酶反应时 ，酶对其中一种化学键优先进行反应。键选择性与酶的来，酶对其中一种化学键优先进行反应。键选择性与酶的来 源和有机介质的种类有关。源和有机介质的种类有关。 例如：脂肪酶催化氨基己醇的酰化反应，底物分例如：脂肪酶催化氨基己醇的酰化反应，底物分 子中的氨基和羟基都可能被酰化，分别生成肽键和酯键。子中的氨基和羟基都可能被酰化，分别生成肽键和酯键。 黑曲霉脂肪酶羟基酰化占优势；黑曲霉脂肪酶羟基酰化占优势； 毛霉脂肪酶则优先氨

21、基酰化；毛霉脂肪酶则优先氨基酰化； 在不同的有机介质中，氨基的酰化与羟基的酰化程度也有所在不同的有机介质中，氨基的酰化与羟基的酰化程度也有所 不同。不同。 热稳定性 l许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中的许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中的 热稳定性更好；热稳定性更好； l酶在有机介质中的热稳定性与介质中的水含量有酶在有机介质中的热稳定性与介质中的水含量有 关；关； l原因：可能是由于有机介质中缺少引起酶分子变原因：可能是由于有机介质中缺少引起酶分子变 性失活的水分子所致。性失活的水分子所致。（水分子会引起酶分子中（水分子会引起酶分子中 天冬酰胺和谷氨酰胺的脱氨基作用、还可能会引天

22、冬酰胺和谷氨酰胺的脱氨基作用、还可能会引 起天冬氨酸肽键的水解、半胱氨酸的氧化、二硫起天冬氨酸肽键的水解、半胱氨酸的氧化、二硫 键的破坏等，所以，酶分子在水溶液中稳定性较键的破坏等，所以，酶分子在水溶液中稳定性较 差）差） 某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性某些酶在有机介质与水溶液中的热稳定性 酶酶 介质条件介质条件 热稳定性热稳定性 猪胰脂肪酶猪胰脂肪酶三丁酸甘油酯三丁酸甘油酯 水，水， ph7.0 t1/2 26 h t1/2 2 min 酵母脂肪酶酵母脂肪酶三丁酸甘油酯三丁酸甘油酯/庚醇庚醇 水，水，ph7.0 t1/2 =1.5 h t1/2 2 min 脂蛋白脂肪酶脂蛋白脂肪酶甲苯

23、，甲苯，90，400 h活力剩余活力剩余40 胰凝乳蛋白酶胰凝乳蛋白酶正辛烷，正辛烷，100 水，水，ph 8.0, 55 t1/2 = 80 min t1/2 = 15 min 枯草杆菌蛋白酶枯草杆菌蛋白酶正辛烷，正辛烷，110t1/2 = 80 min 核糖核酸酶核糖核酸酶壬烷，壬烷，110，6 h 水，水，ph 8.0, 90 活力剩余活力剩余95 t1/2 24 h t1/2 10 min 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 （hind ） 正庚烷，正庚烷，55，30d活力不降低活力不降低 -葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶2-丙醇，丙醇，50，30 h活力剩余活力剩余80 溶菌酶溶菌酶环己烷，环己

24、烷，110 水水 t1/2 =140 min t1/2 = 10 min 第四节第四节 有机介质中酶催化反应的条件及其控制有机介质中酶催化反应的条件及其控制 l酶在有机介质中可以催化多种反应，主酶在有机介质中可以催化多种反应，主 要包括：合成反应、转移反应、醇解反要包括：合成反应、转移反应、醇解反 应、氨解反应、异构反应、氧化还原反应、氨解反应、异构反应、氧化还原反 应、裂合反应等。应、裂合反应等。 1 1、合成反应、合成反应 l原来在水溶液中催化水解反应的酶类，在有 机介质中，由于水的含量极微，水解反应难 以发生。此时，酶可以催化其逆反应，即催 化合成反应。 （1）脂肪酶或酯酶在有机介质中可

25、以催化有 机酸和醇进行酯类的合成反应。 （2）蛋白酶可以在有机介质中催化氨基酸进 行合成反应，生成各种多肽。 2、转移反应、转移反应 l在有机介质中，酶可以催化一些转移反 应。例如，脂肪酶可以催化转酯反应， 即催化一种酯与一种有机酸反应，生成 另一种酯和有机酸。 3、醇解反应、醇解反应 l某些酶在有机介质中可以催化一些 醇解反应。例如，假单孢脂肪酶可 以在二异丙醚介质中催化酸酐醇解 生成二酸单酯化合物。 4、氨解反应、氨解反应 l某些酶在有机介质中可以催化某些 酯类进行氨解反应，生成酰胺和醇 。例如：脂肪酶可以在叔丁醇介质 中催化外消旋苯甘氨酸甲酯进行不 对称氨解反应，将r-苯丙氨酸甲酯 氨解

26、生成r-苯丙氨酰胺和甲醇。 5、异构反应、异构反应 l一些异构酶在有机介质中可以 催化异构反应，将一种异构体 转化为另一种异构体。 6、氧化还原反应、氧化还原反应 l不少氧化还原酶类可以在一定的有 机介质中催化氧化反应，也可以催 化还原反应。 单加氧酶；双加氧酶；脱氢酶； 7、裂合反应、裂合反应 l酶在有机介质中可以催化裂合反应 ，例如，醇腈酶催化醛与氢腈酸反 应生成醇腈衍生物。 主要应控制的条件主要应控制的条件 酶的种类和浓度酶的种类和浓度 底物的种类和浓度底物的种类和浓度 有机溶剂的种类有机溶剂的种类 水含量水含量 温度温度 ph 离子强度离子强度 有机介质中酶催化的应用有机介质中酶催化的

27、应用 l手性药物的拆分手性药物的拆分 l手性高分子聚合物的制备手性高分子聚合物的制备 l酚树脂的合成酚树脂的合成 l导电有机聚合物的合成导电有机聚合物的合成 l发光有机聚合物的合成发光有机聚合物的合成 l食品添加剂的生产食品添加剂的生产 l多肽的合成多肽的合成 l甾体转化甾体转化 l生物能源生物能源 一手性药物的拆分一手性药物的拆分 l 概念：概念： l 手性化合物：是指化学组成相同，而其立体结构手性化合物：是指化学组成相同，而其立体结构 互为对映体的两种异构体化合物互为对映体的两种异构体化合物 1 1 手性药物两种对映体的药效差异手性药物两种对映体的药效差异 l一种有显著疗效，另一种有疗效弱或无效一种有显著疗效，另一种有疗效弱或无效 l一种有显著疗效，另一种有毒副作用一种有显著疗效，另一种有毒副作用 l两种对映体的药效相反两种对映体的药效相反 l两种对映体具有各自不同的药效两种对映体具有各自不同的药效 l两种消旋体的作用具有互补性两种消旋体的作用具有互补性 2 手性药物的拆分方法手性药物的拆分方法 l分为：非生物法、生物法分为：非生物法、生物法 l非生物法（机械分离法、非生物法（机械分离法、 形成和分离对映体异构法、形成和分离对映体异构法、 色谱分离色谱分离 法、法、 动力学拆分）动力学拆分） 生物拆分法原理生物拆分法原理 l实质即两个对