病原菌的分离、纯化和保存

1、 实验十七、病原菌的分离培养、纯化和保存一、目的要求(1)了解分离与纯化微生物的基本原理及方法。(2)掌握倒平板的方法和组织分离、稀释分离、平板划线分离的基本操作技术。(3)掌握在平板、斜面及液体培养基上培养病原菌及观察其培养性状的方法。二、基本原理植物病原菌的分离培养，是植物病理实验室工作中的基本技能。为了获得某微生物的纯培养，一般是根据该微生物对营养、酸碱度、氧气等条件要求不同，而供给它们适宜的生活条件，即让病原菌生活在适宜的培养基上，或加入某种抑制剂造成只利于此菌生长，而抑制其他菌生长的环境，从而得到纯菌株。植物病原真菌的分离方法主要有组织分离法和稀释分离法两种。最常用的方法是组织分离法

2、，而稀释分离法主要用于病组织上产生大量孢子的病原真菌的分离。病原细菌的分离方法以划线分离法为最常用，在有些情况下也采用稀释分离法。为了获得分离菌的纯培养，必须要进行分离菌的纯化，纯化的方法类似于分离工作中采用的稀释分离法或划线分离法。3、 材料、仪器与用具 1材料(依当地情况进行选择，下列材料供参考)(1) 稻瘟病叶、病节、病穗颈(pyricularia orycae)。 (2)玉米大斑病叶(exserohilum turcicum)。(3)玉米弯孢菌叶斑病叶(curvularia lunata)。(4)玉米小斑病叶(bipolaris maydis)。(5)番茄灰霉病果(botrytis c

3、inefca)。(6)黄瓜菌核病果(sclerotinia sclerotiorum)。(7)黄瓜细菌性角斑病叶(pseudomonas syringaepv1achrymans)。(8)水稻白叶枯病叶(xanthomonas campestms pv.oryeue)。(9)大豆细菌性斑点病叶(pseudomonas syringaepvglycinea)。(10)白菜软腐病叶(erudnia carotovora subspcarotovora)。 2培养基 pda培养基；肉膏蛋白胨培养基；加寄主组织煎汁的培养基等。 3仪器与用品 超镜工作台、培养箱、培养皿、吸管、吸水纸、三角玻璃棒、剪刀、

4、解剖刀、镊子、接种铲(针)、接种环(铒)、70酒精、01升汞、酒精灯、火柴、记号笔、橡皮筋套、可调式电炉、铝锅等。01升汞溶液配制：升汞1e 浓盐酸25ml 蒸馏水1000ml。先将升汞溶于盐酸中，待充分溶解后，再加水稀释。升汞是剧毒药物，在操作时应特别小心。四、实验操作 (一)病原真菌的分离1组织分离法 按照以下步骤进行：(1)取灭菌培养皿一个，置于湿纱布上，在皿盖上用玻璃铅笔注明分离日期、材料和分离人的姓名。提示：为了保证无菌操作，应注意下面几点：工作前最好将所需的物品都放在超净工作台内，工作中临时去取容易带来杂菌；保证工作人员自身的洁净，工作前用肥皂洗手；无菌操作前还要用70酒精擦拭双手

5、；工作中，特别在使用无菌操作间时，呼吸要轻，不要说话。(2)用无菌操作法向培养皿中加入25乳酸1-2滴(可减少细菌污染)，然后将融化而冷至60c左右的pda培养基倒人培养皿中，每皿倒10-15ml，轻轻摇动使之成平面。凝固后即成平板培养基。提示：加入25乳酸12滴，可基本保证平板上不出现污染细菌苗落。除乳酸外，在培养基中加入适当的抗菌素抑制细菌的生长，也是常用的方法。加青霉素(20gml)可以抑制g+细菌生长；加多黏霉素b(50gml)可以抑制g细菌生长；加链霉素(40gml)或氯霉素(50gml)可以抑制大部分细菌的生长。除了氯霉素可在灭菌前加入外，其他抗菌素都应在灭菌后并冷却到45c左右(

6、以手背触三角瓶感到烫，但尚可以忍耐为宜)时加入。倒平板过程中只要遵循“稳、轻、快”要领，不必在火焰上方，一般很少污染。(3)取真菌叶斑病的新鲜病叶(或其他分离材料)，选择典型的单个病斑，用剪刀或解剖刀从病斑边缘(病健交界处)切取小块(海边长3-4mm)病组织数块。提示：选择新患病的组织作为分离的材料，可以减少腐生菌混入的机会。腐生菌一般在发病很久而已经枯死或腐败的部分滋生，因此，一般斑点病害应在临近健全组织的部分分离。(4)将病组织放人70酒精中浸35s后，按无菌操作法将病组织移人01升汞液中分别表面消毒05、1、2、3、5rain(也可使用其他表面消毒剂)，如植物组织柔嫩，则表面消毒时间宜短

7、；反之则可长些。然后放入灭菌水中连续漂洗三次，除去残留的消毒剂。提示：先用70的酒精浸2、3s是为了消除寄主表面的气泡，减少表面张力，70的酒精亦用于表面消毒，处理的时间较短(一般数秒至lmin)。升汞溶液消毒的时间因材料而异，可自30s至30min不等，一般情况下，需时间3，5min。(5)用无菌操作法将病组织移至平板培养基上，每皿内放4-6块。提示：在将病组织小块移放到平板表面之前，应将其在无菌吸水纸上吸去多余的水，以大大减少病组织附近出现细菌污染。(6)将培养皿倒置放人2512左右恒温箱内培养。一般34d后观察待分离菌生长结果。 (7)若病组织小块上均长出较为一致的菌落，则多半为要分离的

8、病原菌。在无菌条件下，用接种针(铲)自菌落边缘挑取小块移入斜面培养基上，在25左右恒温箱内培养，数日后，观察菌落生长情况，如无杂菌生长，即得该分离病菌纯菌种，便可置于冰箱中保存。提示：除根据菌落的一致性初步确定长出的菌落是否目标菌外，还要在显微镜下检查，进一步确定。如果是对未知病原菌的组织分离，则要将长出的蕾落分别转出，通过进一步的接种实验明确哪一种为其病原菌。在组织分离工作中，如果植物材料体积较大且较软(如患灰霉病的番茄果实)，在分离过程中可直接挖取内部患病组织移人平板培养基上，完成分离工作。2稀释分离法(1)取灭菌培养皿三个，平放在湿纱布上，编号，并注明日期、分离材料及分离人姓名。(2)用

9、灭菌吸管吸取灭菌水，在每一皿中分别注入0510ml。(3)用移植环蘸一滴孢子悬浮液，与第一个培养皿中的灭菌水混合，再从第一个培养皿移三环到第二个培养皿中，混合后再移三环到第三个培养皿中。(4)将熔化开冷却到4550c的培养基，分别倒在三个培养皿中(为防止细菌污染，也可以向每个培养皿中事先加入1-2滴25乳酸)，摇匀，凝固，要使培养基与稀释的菌液充分混匀。提示：倒平板时的培养基温度一定要掌握好，过热易将病原菌烫死而使分离失败，过冷则倒入培养皿中后难以形成平板，而成为起伏不平的表面，不利于分离。为大体估计培养基温度，可将盛培养基的器皿靠在人手背上，如果手背感到烫但尚可以忍耐，则大体为4550c。(

10、5)将培养皿翻转后置恒温箱(2513)中培养，数日后观察菌落生长情况。(6)挑菌。将培养后长出较为整齐一致的单个菌落分别挑取，接种到斜面培养基上，置25左右培养。待菌长出后，检查菌是否单纯，若有其他菌混杂，就要再一次进行分离纯化，直到获得纯株培养。(二)病原细菌的分离病原细菌的分离方法以稀释分离法和划线分离法为最常用。在进行分离之前，首先应对病组织材料进行细菌学初步诊断，即经过镜检确认有喷菌现象以后，才对该病组织作分离工作。稀释分离法是最经典的标准分离法，方法同上述真菌分离。除去上述稀释分离法以外，较为方便的是划线分离法：(1)预先把熔化好的肉膏蛋白胨培养基倒在培养皿中，凝成平板后，翻转放在3

11、0c恒温箱中24h，使表面无水滴凝结。也可凝成平板后直接使用。(2)将病组织先用01升汞表面消毒05-2min，再用无菌水换洗3次后，放在灭菌培养皿中的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎，并让组织碎块在水中浸泡2060min，让细菌释放到灭菌水中。(3)用灭菌的接种铒(接种环)蘸取浸泡液在干燥的培养基平板表面划线，尽量不要把平板表面划破。划过第一批线后的接种环应放在火焰上烧灼冷却后直接在第一批划线的末端向另一方向划线。灭菌后再划第三次线。提示：划过第一批线后接种铒放在火焰上烧过这一步骤非常重要，这样做可以使第一批线和第二批线上的细菌数量相差很大。(4)用玻璃铅笔在培养皿上写上分离材料、日期和分离者姓名后

12、，翻转培养皿，放在2628c恒温箱中培养。13d后观察有无细菌生长，在哪些地方有单菌落生长出来?其中的优势单菌落应为待分离菌形成的。(5)仔细挑取病原菌的单菌落，并移植到斜面培养基上。同时，再把单菌落用灭菌水稀释成悬浮液作第二次划线分离，经培养后出现的菌落在形态特征都趋于一致，并与典型描述的特征相一致时，即表明已获得纯培养。最好要经过连续三次单菌落的分离，才能确保纯化。(三)真菌、细菌培养性状观察1真菌培养性状观察 取已分离、纯化的某种真菌菌种，按前述稀释分离法中(1)-(5)步骤进行，待某培养皿中形成单个菌落后观察。记载以下内容：菌落颜色、菌丛密集及繁茂程度、是否有色素分泌出来而渗透到培养基

13、中、菌落生长速度快慢等。同时要记载培养基种类(成分及ph)和培养温度、光照条件。2细菌培养性状观察(1)仿照上述真菌菌落形成步骤，观察记载以下内容：菌落颜色、菌落边缘形状、菌落表面是光亮还是粗糙或有皱折、菌落隆起情况、是否有色素分泌到培养基中，菌落生长速度快慢，是否有特殊气味形成等。同时要记载培养基种类(成分及ph)和培养温度、光照条件。(2)用接种铒(环)蘸细菌菌种后，通过无菌操作在肉膏蛋白胨等斜面培养基表面从下向上划一直线，过23d后长出的细菌群体称为菌苔，可仿照观察记载细菌菌落的记载内容，记载菌苔颜色、边缘形状、表面是光亮还是粗糙有皱折、隆起情况、是否有色素分泌到培养基中，是否有特殊气味

14、生成，生长速度快慢等。也要记载培养基种类(成分及ph)和培养温度、光照条件。(3)用接种铒(环)蘸取细菌菌种后，通过无菌操作，将其接种在某种液体培养基中，数日后观察记载培养基中是否变混浊、是否有色素、气体、沉淀生成，培养液表面是否可生成菌膜等。也要记载培养基种类(成分及ph)和培养温度、光照条件。五、所需时间流程 1病原真菌分离组织分离：切取病组织，表面消毒，无菌水洗移人平板：1h。稀释分离：配孢子悬液，倒平板il培养7-10d分离菌移人斜面30min培养7-10d检查斜面上分离菌产孢30min保存菌种 2病原细菌分离划线分离：倒平板沾菌悬液划线，1h。稀释分离 3病原真菌、细菌菌落培养性状观

15、察 平板上形成单菌落1-3d观察写报告 4病原细菌菌苔培养性状观察 斜面上形成菌苔i-3d观察30min写报告 5病原细菌液体培养性状观察 接菌于液体培养基30min培养2-3d观察30min写报告。六、思考题 1如果要分离的病原真菌是鞭毛菌中的腐霉菌、疫霉菌等应当如何进行才会获得更好的效果? 2在分离病原真菌时，向平板培养基中加人乳酸为什么会大大减少细菌的污染? 3如果要从土壤中分离某种病原菌，应当采取什么样的分离方法会更有效? 4观察记载真菌及细菌的培养性状有何意义? 5怎样才能知道你获得的病原真菌、细菌的菌种是否是纯培养?附1 常用的几种典型的病原菌分离方法1斑点病原菌的分离。从病斑部分

16、切取每边35mm的小块组织，在70酒精中浸数秒钟后，移人01的升汞水溶液中处理35rain，以灭菌水冲洗3次，移置培养皿的培养基中，然后培养。2维管束组织内病原菌的分离。从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。3根腐病病原菌的分离。根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。4肉质组织中病原菌的分离。多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。

17、如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。5种子内病原菌分离。将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉)，用灭菌水洗涤后，移置培养基上。6孢子分离法。能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等，则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。7土壤带菌分离法。为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。摘要：介绍了植物可培养性病原菌的几种常用保存方法，如甘油冷冻保藏法、冷冻干燥保藏法、滤纸保藏法、沙土保藏法、斜面低温保藏法、液氮冷冻保藏法和液体石蜡保藏法。 1甘油冷冻保藏法

18、 本方法适合于中、长期菌种保藏，保藏时间一般为24年左右。用火焰灭菌的接种环取斜面菌种在平皿上划线分离单菌落；平皿倒置于30或37恒温培养箱，培养2448h，至单菌落的大小为3mm左右；挑取1个单菌落，接种于1个装50ml lb的300ml三角瓶中30或37振荡培养1015h，至菌密度od600为1.01.5；用火焰灭菌的接种环取少量种子液，涂片后，作革兰氏染色，在显微镜下观察菌体的形态及是否有杂菌；按30%甘油种子液为11（v/v）的量加入无菌甘油，混合后分装至事先灭菌的菌种保存管（12ml/管），-70或液氮保存。2冷冻干燥保藏法 此法为菌种保藏方法中最有效的方法之一，对一般生活力强的微生

19、物及其孢子以及无芽胞菌都适用。即使对一些很难保存的致病菌亦能保存。适用于菌种长期保存，一般可保存数年至10余年，但设备和操作都比较复杂。（1）准备安瓿管。用于冷冻干燥菌种保藏的安瓿管宜采用中性玻璃制造，形状可用长颈球形底的，亦称泪滴型安瓿管，大小要求外径6.07.5mm，长105mm，球部直径911mm，壁厚0.61.2mm。也可用没有球部的管状安瓿管。塞好棉塞，1.05kg/cm2、121.3，灭菌30min，备用。（2）准备菌种。用冷冻干燥法保藏的菌种，其保藏期可达数年至10余年。为了在许多年后不出差错，故所用菌种要特别注意其纯度，即不能有杂菌污染，然后在最适培养基中用最适温度培养，使其培

20、养出良好的培养物。细菌和酵母的菌龄要求超过对数生长期，若用对数生长期的菌种进行保藏，其存活率反而降低。一般细菌要求2448h的培养物；形成孢子的微生物则宜保存孢子；丝状真菌则培养710d。（3）制备菌悬液与分装。以细菌斜面为例，用脱脂牛乳2ml左右加入斜面试管中，制成浓菌液，每支安瓿管分装0.2ml。（4）冷冻。冷冻干燥器有成套的装置出售，价值昂贵，此处介绍的是简易方法与装置，可达到同样的目的。将分装好的安瓿管放低温冰箱中冷冻，无低温冰箱可用冷冻剂如干冰（固体co2）酒精液或干冰丙酮液，温度可达-70。将安瓿管插入冷冻剂，只需冷冻45min，即可使悬液结冰。（5）真空干燥。为在真空干燥时使样品

21、保持冻结状态，需准备冷冻槽，槽内放碎冰块与食盐，混合均匀，可冷至 -15。装置仪器，安瓿管放入冷冻槽中的干燥瓶内。抽气一般若在30min内能达到93.3pa真空度时，则干燥物不致熔化，以后再继续抽气，几小时内，肉眼可观察到被干燥物已趋干燥，一般抽到真空度26.7pa，保持压力68h即可。（6）封口。抽真空干燥后，取出安瓿管，接在封口用的玻璃管上，可用l形五通管继续抽气，约10min即可达到26.7pa。于真空状态下，以煤气喷灯的细火焰在安瓿管颈中央进行封口。封口以后，保存于冰箱或室温暗处。3滤纸保藏法 细菌和丝状真菌均可用此法保藏，可保藏2年左右，有些丝状真菌甚至可保藏1417年之久。此法较液

22、氮、冷冻干燥法简便，不需要特殊设备。将滤纸剪成0.5cm1.2cm的小条，装入0.6cm8.0cm的安瓿管中，每管12张，塞以棉塞，1.05kg/cm2、121.3，灭菌30min；将需要保存的菌种，在适宜的斜面培养基上培养，使充分生长；取灭菌脱脂牛乳12ml滴加在灭菌培养皿或试管内，取数环菌苔在牛乳内混匀，制成浓悬液；用灭菌镊子自安瓿管取滤纸条浸入菌悬液内，使其吸饱，再放回至安瓿管中，塞上棉塞；将安瓿管放入内有五氧化二磷作吸水剂的干燥器中，用真空泵抽气至干；将棉花塞入管内，用火焰熔封，保存于低温下；需要使用菌种，复活培养时，可将安瓿管口在火焰上烧热，滴1滴冷水在烧热的部位，使玻璃破裂，再用镊

23、子敲掉口端的玻璃，待安瓿管开启后，取出滤纸，放入液体培养基内，置温箱中培养。4沙土保藏法 此法多用于能产生孢子的微生物，如霉菌、放线菌，在抗生素工业生产中应用最广，效果亦好；但应用于营养细胞效果不佳。取河沙加入10稀盐酸，加热煮沸30min，以去除其中的有机质；倒去酸水，用自来水冲洗至中性；烘干，用40目筛子过筛，以去掉粗颗粒，备用；另取非耕作层的不含腐植质的瘦黄土或红土，加自来水浸泡洗涤数次，直至中性；烘干，碾碎，通过100目筛子过筛，以去除粗颗粒；按1份黄土、3份沙的比例（或根据需要而用其他比例，甚至可全部用沙或全部用土）掺合均匀，装入10mm100mm的小试管或安瓿管中，每管装1g左右，

24、塞上棉塞，进行灭菌，烘干；抽样进行无菌检查，每10支沙土管抽1支，将沙土倒入肉汤培养基中，37培养48h，若仍有杂菌，则需全部重新灭菌，再作无菌试验，直至证明无菌，方可备用；选择培养成熟的（一般指孢子层生长丰满的，营养细胞用此法效果不好）优良菌种，以无菌水洗下，制成孢子悬液；于每支沙土管中加入约0.5ml（一般以刚刚使沙土润湿为宜）孢子悬液，以接种针拌匀；放入真空干燥器内，用真空泵抽干水分，抽干时间越短越好，务使在12h内抽干；11每10支抽取1支，用接种环取出少数沙粒，接种于斜面培养基上，进行培养，观察生长情况和有无杂菌生长，如出现杂菌或菌落数很少或根本不长，则说明制作的沙土管有问题，尚须进

25、一步抽样检查；12若经检查没有问题，用火焰熔封管口，放冰箱或室内干燥处保存。每半年检查1次活力和杂菌情况；13需要使用菌种，复活培养时，取沙土少许移入液体培养基内，置温箱中培养。5斜面低温保藏法 将菌种接种在适宜的固体斜面培养基上，待菌充分生长后，棉塞部分用油纸包扎好，移至28的冰箱中保藏。保藏时间依微生物的种类而有所不同，霉菌和有芽孢的细菌保存24个月，移种1次。细菌最好每月移种1次。此法为实验室和工厂菌种室常用的保藏法，优点是操作简单，使用方便，不需特殊设备，能随时检查所保藏的菌株是否死亡、变异与污染杂菌等。缺点是容易变异。因为培养基的物理、化学特性不是严格恒定的，屡次传代会使微生物的代谢改变，而影响微生物的性状；污染杂菌的机会亦较多。6液氮冷冻保藏法 此法除适宜于一般微生物的保藏外，对一些用冷冻干燥法都难以保存的微生物，难以形成孢子的霉菌均可长期保藏，而且性状不变异。缺点是需要特殊设备。（1）准备安瓿管。用于液氮保藏的安瓿管，要求能耐受温度突然变化而不致破裂。因此，需要采用硼硅酸盐玻璃制造的安瓿管，通常使用安瓿管的大