毛细管电泳法测定麻黄及麻杏石甘汤中主成分的含量

1、毛细管电泳法测定麻黄及麻杏石甘汤中主成分的含量景浩然，郭怀忠*，王子君，王敏，张斌 （河北大学药学院，河北 保定 071002；河北省药物质量研究重点实验室，河北 保定 071002)摘要:目的 建立了毛细管区带电泳法测定麻黄及麻杏石甘汤中麻黄碱和伪麻黄碱含量的方法。方法 电泳条件：电泳缓冲液为50 mmol/L硼砂-20 mmol/L苏氨酸缓冲溶液(1 mol/LNaOH溶液调pH至9.27)；紫外检测波长210 nm，分离电压15 kV；以苯巴比妥为内标物，采用压力进样（10 cm20 s），柱温：室温。结果麻黄碱与伪麻黄碱的线性范围分别为21.3213 g/mL和8.484 g/mL，相

2、关系数分别为0.9996和0.9995，检测限分别为1.45 g/mL和1.48 g/mL，定量限分别为4.81 g/mL和4.93 g/mL。将该法用于麻黄中麻黄碱与伪麻黄碱的含量测定，平均回收率分别为97.5%和98.6%。结论 本法操作简便、快速、经济、灵敏度高，麻黄及麻杏石甘汤中麻黄碱及伪麻黄碱可获得满意的分离，可作为麻黄和麻杏石甘汤中麻黄碱和伪麻黄碱的含量测定方法。关键词：高效毛细管电泳法 麻黄 麻杏石甘汤 麻黄碱 伪麻黄碱Determination of Main component in Ephedra and Maxingshigan Decoction by Capillar

3、y Zone ElectrophoresisJING Haoran, GUO Haizhong*, WANG Zijun, WANG Min, ZHANG Bin(School of Pharmacy, Hebei University, Baoding 071002；Hebei Key Laboratory of Drug Quality Research)Abstract: Objective To establish a method for the determination of ephedra ephedrine and pseudoephedrine in ephedra and

4、 maxingshigan decoction by capillary zone electrophoresis.Method The conditions of the experiment were optimized with a fused-silica capillary of 60 cm50 m i.d. (50 cm effective length ) in a running of 50 mmol/L borax-20 mmol/L threonine (pH9.27) with an applied voltage of 15 kV(room 第一作者介绍：景浩然，女，研

5、究生，Email:haoranjing1980通讯联系人：郭怀忠，男，副教授，主要从事中药分析方面的研究，Tel:(0Email:ghuaizhtemperature). Sample introduction was performed by hydrodynamic injections(10 cm20 s) and determined with on-column UV monitoring at 210 nm. Phenobarbital was chosen as the internal standard. Ephedrine and pseudoeph

6、edrine are separated successfully within 8 min. Results The linear responses covered the ranges from 21.3 to 213 g/mL(r=0.9996) for ephedrine and from 8.4 to 84 g/mL(r=0.9995) for pseudoephedrine. The detection limits(S/N=3) of ephedrine and pseudoephedrine were shown to be 1.45 g/mL and 1.48 g/mL,

7、respectively, The quantitation limits (S/N =10)of ephedrine and pseudoephedrine were shown to be 4.81 g/mL and 4.93 g/mL, respectively. The average recoveries for ephedrine and pseudoephedrine were 97.5% and 98.6% with RSD less than 5.0%. Conclusion The method is simple, rapid, cost-effective and pr

8、ecise with satisfactory results.Key words: capillary electrophoresis; ephedra; Maxingshigan Decoction; ephedrine; pseudoephedrine麻黄为麻黄科植物草麻黄的干燥草质茎，始载于神农本草经。临床上用于治疗呼吸道疾患，具有发汗散寒、宣肺平喘、利水消肿的功效1。麻杏石甘汤出自伤寒论，由麻黄、杏仁、生石膏和甘草四味中药组成，具有解热、抗炎、镇咳、祛痰等药理作用，主治肺热炽盛的肺炎和热邪犯肺的哮喘，临床应用广泛2，其中麻黄是本方的主药，主含麻黄碱和伪麻黄碱，2005版中国药典的麻黄

9、药材的质控标准中采用测定麻黄碱的含量来控制麻黄药材的质量，未能提供同时测定麻黄碱及伪麻黄碱的方法。麻黄碱与伪麻黄碱是一对理化性质极其相似的差向异构体，一般条件下不易分离，目前同时测定麻黄药材及其制剂中的麻黄碱和伪麻黄碱大多采用薄层扫描法3和高效液相色谱法4-6，但以上两种方法普遍具有分离效果差或分析时间长的缺点。毛细管电泳(capillary electrophoresis, CE)作为一种高效分离分析方法，具有分析速度快、分离效率高、运行成本低等优点，目前已在药物质量控制、手性拆分及体内药物分析等方面获得了成功的应用7。本文采用毛细管区带电泳法(CZE)，以苯巴比妥为内标，分离了麻黄碱和伪麻

10、黄碱，建立了麻黄药材的测定和质量评价方法，并首次为麻杏石甘汤中麻黄碱类成分含量测定提供了参考。1 实验部分1.1仪器与试药CL1020高效毛细管电泳仪(北京彩陆科学仪器有限公司)；未涂层熔融石英毛细管柱(内径50 m，总长60 cm，有效长度50 cm，河北永年锐沣色谱器件有限公司)；HW2000色谱工作站；pHS-3C型酸度计(上海理达仪器厂)；分析天平(AG204，瑞士METTLER TOLEDO)；超声波清洗仪（DS2060，天津市东康科技有限公司） 甲醇(色谱纯及分析纯)，其它所用氯仿、氨水、硼砂和氢氧化钠等均为分析纯；苏氨酸和苯巴比妥（药用）、盐酸麻黄碱对照品、盐酸伪麻黄碱对照品 (

11、中国药品生物制品检定所)；麻黄、甘草、杏仁、生石膏（均经保定市药品检验所副主任药师张建英鉴定合格，其中麻黄为草麻黄Ephedra sinica)(市售)；重蒸馏水。1. 2 实验方法1.2.1电泳条件新毛细管在使用前依次用 1 mol/L NaOH溶液、0.1 mol/L NaOH溶液、水各冲洗20 min，再用分离缓冲溶液冲洗10 min。每天使用前依次用0.1 mol/LNaOH溶液、水、分离缓冲溶液冲洗10 min，两次测定之间用分离缓冲溶液冲洗5 min，样品采用重力进样，进样高度10 cm，进样时间20 min，电压15 kV，紫外检测波长为210 nm。1.2.2缓冲溶液的配制称取

12、硼砂0.95 g至50 mL水中，搅拌溶解，称取苏氨酸0.119 g，加上述溶液12.5 mL溶解并稀释至50 mL，用1 mol/LNaOH溶液调pH值至pH9.27，即得50 mmol/L硼砂-20 mmol/L苏氨酸缓冲溶液。1.2.3对照品溶液的制备盐酸麻黄碱对照品溶液：精密称取盐酸麻黄碱对照品0.0213 g，置50 mL量瓶中，加甲醇35 mL，振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀。盐酸伪麻黄碱对照品溶液：精密称取盐酸伪麻黄碱对照品0.0218 g，置100 mL量瓶中，加甲醇80 mL，振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀。苯巴比妥(内标)溶液：称取苯巴比妥原料药0.0508 g，置50 m

13、L量瓶中，加入甲醇35 mL，振摇使溶解，并稀释至刻度，摇匀。1.2.4供试品溶液的制备精密称取麻黄适量（约0.1 g），研细，置圆底烧瓶中，加入20 mL氯仿、4 mL氨水，精密称定，浸渍过夜，再精密称定重量后，用氯仿补足减失重量，精密加入4 mL甲醇，加热回流2 h，放冷，摇匀滤过，残渣用氯仿洗三次，每次3 mL，合并氯仿液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中，精密加入内标溶液1 mL，用甲醇稀释至刻度，摇匀滤过，取续滤液作为麻黄供试品溶液。按处方8称取药材麻黄1 g、苦杏仁1.5 g、甘草1 g和生石膏4 g，加10倍量水常温浸渍30 min，煎煮，保持微沸30 min，趁热过

14、滤，滤渣加7倍量水继续煎煮，保持微沸20 min，趁热滤过，合并两次滤液，药渣水洗三次9，与滤液合并，旋转蒸干，残渣加入20 mL氯仿、4 mL氨水，称定重量，浸渍过夜，再称定重量，用氯仿补足减失重量，精密加入4 mL甲醇，加热回流2 h，放冷，摇匀滤过，残渣用氯仿洗三次，每次3 mL，合并氯仿液，蒸干，残渣用甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中，精密加入内标溶液1 mL，加甲醇至刻度，摇匀滤过，取续滤液作为麻杏石甘汤供试品溶液。2 结果2.1线性范围、检测限及定量限精密量取盐酸麻黄碱、盐酸伪麻黄碱对照品溶液及内标溶液适量，置10 mL量瓶中，加甲醇制成系列浓度的标准溶液，在上述所选电泳条件下进行

15、测定，以对照品溶液的浓度为横坐标，相应的峰面积比值AI/AS（AI 代表对照品的峰面积，AS代表内标物的峰面积）为纵坐标，进行线性回归。结果在21.3 g/mL213 g/mL及8.4 g/mL84 g/mL的范围内，麻黄碱和伪麻黄碱溶液的浓度与峰面积比值呈良好的线性关系，回归方程分别为：Y=0.0046x+0.0099（r=0.9996）和Y=0.0053x+0.0031（r=0.9995）。以3倍信噪比确定麻黄碱和伪麻黄碱的检测限分别为1.45 g/mL和1.48 g/mL，以10倍信噪比确定麻黄碱和伪麻黄碱的定量限分别为4.81 g/mL和4.93 g/mL。2.2精密度实验2.2.1日

16、内精密度试验分别精密量取1.2.3项下盐酸麻黄碱及盐酸伪麻黄碱对照品溶液2 mL和3 mL与苯巴比妥对照品溶液0.5 mL置10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，重复进样5次。测得麻黄碱与内标峰面积比值及伪麻黄碱与内标峰面积比值的RSD分别为0.9%和1.5%。2.2.2日间精密度试验连续5天重复进样2.3.1项下对照品溶液，测得麻黄碱与内标峰面积比值的RSD为1.2%；伪麻黄碱与内标峰面积比值的RSD为1.6%。2.3重复性试验和稳定性实验取同一批号麻黄药材，照1.2.4.1项下方法制备五份供试品溶液，分别进样，记录峰面积，结果麻黄碱与内标峰面积比值及伪麻黄碱与内标峰面积比值基本不变，RSD分

17、别为 0.9%和1.6%，表明本方法的重复性较好。取上述制备的一份供试品溶液分别于0，2，4，6，8，12 h进样，记录峰面积，结果麻黄碱和伪麻黄碱峰面积比值基本不变，RSD分别为1.5%和1.3%，表明供试品溶液至少在12 h内稳定。2.4回收率的测定本文采用麻黄药材加标的方法进行了回收率测定，结果见表1。由表1的数据可知，麻黄碱及伪麻黄碱的回收率分别为 95.7%97.9%和95.2%104.8%，RSD 分别为1.6%和4.1%。结果表明方法的准确度良好。2.5含量测定麻杏石甘汤的色谱图中，在麻黄碱、伪麻黄碱及内标物的出峰位置，未见杂质峰干扰，因此我们在麻黄药材方法学研究的基础上，对不同

18、来源的2批麻黄药材及麻杏石甘汤中的麻黄碱及伪麻黄碱，依法测定含量。结果见表1。表1 麻黄及麻杏石甘汤中主成分的含量测定结果Table 1Contents of the two batches of ephedra and Maxingshigan Tangsample batch (mg/g) RSD(%) (mg/g) RSD(%)ephedra 1 6.689 0.4 2.562 2.9 2 4.981 1.0 1.735 0.6Maxingshigan Tang 1 0.874 2.2 0.279 0.4 2 0.613 3.5 0.219 3.23 讨论3.1背景缓冲溶液 pH值对分离

19、度的影响缓冲液pH值对麻黄碱和伪麻黄碱的分离效果影响很大，我们选取pH3.0、7.0、10.0、12.0进行测定，发现随着pH值的增加，两峰分离度先增大后减小，迁移时间逐渐增加（见图1），在pH10左右分离度最大。进而在pH10附近选取若干个点进行pH值筛选，发现在pH9.2-9.3范围内，峰形较好，分离度最佳。分析其原因，主要是pH值过低时，麻黄碱(Pka值9.58)和伪麻黄碱(Pka值9.74)在酸性条件下不能很好地游离出来，故分离效果较差，pH值过高，峰形变差，发现分离效果也不好。本实验选择pH9.27作为缓冲液的pH值。图1 pH对分离度的影响Fig. 1Effect of pH on

20、 resolution 3.2缓冲溶液组成的影响由于麻黄药材成分复杂，干扰主成分测定的杂质较多，一般条件下不易分离，目前分离麻黄碱和伪麻黄碱常用的缓冲系统有异亮氨酸10、缬氨酸11，我们在此基础上还尝试了组氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸、盐酸赖氨酸等九种水溶性氨基酸缓冲系统，结果发现苏氨酸较其他几种氨基酸分离效果更好。我们考虑将氨基酸加入缓冲液中增加分离度的主要原因为此九种氨基酸均为L-氨基酸，对麻黄碱和伪麻黄碱的选择性程度不同，均可以增加两个生物碱的分离度。在此九种氨基酸中苏氨酸结构较简单，分子量较小，相同质量的苏氨酸摩尔数高，对分离度的影响更明显。通过对加入不同浓度苏氨酸的考察，发现增大浓度能够改

21、善分离，但是由于检测波长为210 nm，浓度过高会增加背景吸收，降低灵敏度，故最终选用苏氨酸浓度为20 mmol/L。3.3内标的选择由于毛细管电泳仪无定量环进样，绝对进样量不容易控制，故选用内标法测定。在选择内标物时，我们选择了在210 nm波长处有较大吸收的物质，如硫脲、水杨酸、苯巴比妥、赖氨酸、精氨酸、组氨酸等，鉴于供试液成分复杂，最终选取其他成分无干扰并与待测组分峰迁移时间最接近的苯巴比妥作为内标物。3.4麻黄供试液提取方法选择本实验曾尝试如下提取方法：（1）酸水超声提取法，即以酸水（用盐酸调pH3.5）为溶剂，取适量麻黄，加八倍量酸水浸泡过夜，分别超声40、30、20 min，合并三

22、次滤液作为供试液，此法对待测成分的干扰较多，分离度较差；（2）回流提取法，即取适量麻黄，加浓氨溶液4 mL，浸渍过夜，再加甲醇适量，回流若干小时，结果发现此法干扰成分较少，对待测成分的测定无干扰。而后，我们又对分别加入甲醇2、3、4、5、6 mL进行实验，结果发现加入甲醇4 mL时即可提取完全；通过回流0.5、1、1.5、2、2.5、3 h进行实验，发现回流2 h时提取完全，故选用回流提取法。在上述操作条件下，麻黄碱和伪麻黄碱分离度较好，空白溶液与样品溶液峰没有重叠。空白溶剂甲醇、对照品溶液、麻黄供试液和麻杏石甘汤供试液毛细管电泳图谱见图2。ab321c321d321图2 电泳谱图 (a) 溶

23、剂甲醇电泳谱图、（b）对照品电泳谱图、（c）麻黄供试液电泳谱图和（d）麻杏石甘汤供试液电泳谱图1.麻黄碱；2.伪麻黄碱 3.苯巴比妥Fig. 2Electropherograms of (a) solvent of methanol;(b) mixture of ephedrine and pseudoephedrine standard solutions;(c)ephedra sample and (d) Maxingshigan Tang sample1. ephedrine; 2. pseudoephedrine; 3. Phenobarbital参考文献1 JI YB，CHEN YY

24、，WU RJDetermination of ephedrine alkaloids in Ephedra sinica by nonaqueous capillary electrophoresisJJournal of chinese herbal medicine，2003，34：112711292 WEI XH，ZHANG ZW，SUN XMGeneral research of MaxingshigantangJJournal of Shandong University of Traditional Chinese Medicine，2003，27：72743 ZENG Q，LIU

25、 CJ，ZHENG LZ，et alSeparation and Determination of Diastereomers l-Ephedrine and d-Psendoephedrine in Ephedra Herba and its Processed ProductsJJournal of China Pharmaceutical University，1990，21(15)：2362384 GE B，LUO YM，XU HX，et alThe content of pseudoephedrine and ephedrine were determined by HPLCJJou

26、rnal of the Chinese Pharmaceutical Association，2008，43（3）：1731755 ZOU P，ZHANG ZQDetermination of ephedrine alkaloids in Xiaoerqingrezhike Oral Liquid by HPLC JChemical Analysis Measurement，2006，15（1）：24256 LIU T，WANG XH，ZHAO YL，et alDetermination of Ephedrine and Psendoephedrine in Maxingshigan Decoction by Ion ChromatographyJJo