酶联免疫吸附试验

1、4 1-护Lwl + 人 ”肿玷合c.，： J实验三酶联免疫吸附试验（ELISA）、实验目的了解ELISA的基本原理，掌握间接ELISA方法的原理与操作步骤。二、实验原理将抗原或抗体固化于某种载体的表面，并保持其免疫活性，加入待检血清（抗体），然后加入与其相对应的既有酶活性又有免疫活性的酶标抗体或抗原，它们之间反应后，通过洗涤去掉未结合的标记物。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，酶的 降解底物和呈现的色泽在一定条件下是呈正比的，故可根据颜色反应的深浅进行定性或 定量分析，因此可用分光光度计进行测定，计算出参加反应的抗原或抗体的含量，从而达到测定抗原或抗体的目的。n拉瞅喘附于h加It

2、楡比沾常用酶及底物常用酶底物加终止液前颜色加终止液后颜色辣根过氧化物酶（HRP邻苯二胺（OPD橙黄色棕黄色RZ3.1四甲基联苯胺（TMB蓝色黄色碱性磷酸酶（AP）对硝基苯磷酸酯（p-NPP）黄色黄色根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。 常用的三种类型：1、间接法测抗体（间接ELISA）间接法用于测定抗体。 它的原理是将已知抗原连接在固相载体上，待测抗体与抗原结合 后再与酶标二抗结合，形成抗原 -待测抗体 -酶标二抗的复合物，复合物的形成量与待测抗体 量成正比，属 非竞争性 反应类型。2、双抗体夹心法（双抗夹心 ELISA）双抗体夹心法用于检测抗原。它是

3、利用待测抗原上的两个抗原决定簇 A和B分别与固相 载体上的抗体A和酶标记抗体B结合，形成抗体A-待测抗原-酶标抗体B复合物，复合物的 形成量与待测抗原含量成正比，属非竞争性反应类型。 操作 ：将抗体吸附于固相表面；加抗 原，形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物。底物的降解量=抗原量。3、竞争 ELISA竞争法既可用于检测抗原又可用于检测抗体。 它是用酶标抗原（抗体）与待测的非标记 抗原（抗体）竞争性的与固相载体上的限量抗体（抗原）结合，待测抗原（抗体）多，则形 成非标记复合物多，酶标抗原与抗体结合就少，也就是酶标记复合物少，因此，显色程度与 待测物含量成反比。三、主要仪器及试材以伪狂犬全病

4、毒（PRV间接酶联免疫吸附试验（PRV- ELISA）为例。使用猪伪狂犬抗体检测试剂盒。本试剂盒含 :1 、包被抗原的微孔板 ； 2 、阴、阳性对照血清；3 、抗猪 IgG-HRP 结合物；4、洗涤液；5、底物A液、B液；6终止液;7、样品稀释液本实验所需仪器和试剂：1、酶联免疫测定仪2、 已包被抗原（Ag）的酶标板（PRV蛋白）3、血清：PRV阳性血清、PRV阴性血清、待检样品血清4、酶标抗体（E-Ab）:兔抗猪IgG-HRP5、 包被液（0.025mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液）：1.59g NaCOs, 2.93g NaHCO，力卩 ddH O 至 1000mL6、洗涤液（0.05%

5、 Tween-20 的 PBS （ pH7.4 ） :8.0g NaCI ，0.2g KCl，2.9gNqHPO 12HO, 0.2g KH2PQ, 0.5mL 吐温-20 （Twee n-20）,力卩 ddH2O 至 1000mL7、保温液（含 0.1% BSA的洗涤液）：0.1g牛血清白蛋白（BSA,洗涤液100mL8、底物液（ TMB-H2O2）：磷酸盐 -柠檬酸盐缓冲液（ pH5.0）：25.7mL 0.2mol/L Na 2HPO4，24.3mL 0.1mol/L 柠 檬酸液，加 50mL ddH2O。TMB母液：0.2g TMB干粉溶于100mL无水乙醇中配制而成。底物液（TMB：

6、新鲜配制。TMB母液用底物缓冲液按1 : 20的比例稀释，每毫升底物 液加入0.2卩L 30% H2Q。9、终止液： 0.25% 氢氟酸四、实验方法与步骤（一：试剂配制1、 包被液（0.025mol/L pH9.6碳酸盐缓冲液）：1.59g NaCOa, 2.93g NaHCO，力卩 ddH2O 至 1000mL2、洗涤液（ 0.05% Tween-20 的 PBS（ pH7.4：8.0g NaCl ， 0.2g KCl ， 2.9gNaHPO 12HO, 0.2g KH2PO, 0.5mL 吐温-20 （Tween-20）,力卩 ddHO至 1000mL3、保温液（含 0.1% BSA的洗涤

7、液）：0.1g牛血清白蛋白（BSA,洗涤液100mL4、底物液（ TMB-H2O2：磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液（ pH5.0,： 25.7mL 0.2mol/L Na 2HPO4， 24.3mL 0.1mol/L 柠 檬酸液，加 50mL ddH2O。TMB母液：0.2g TMB干粉溶于100mL无水乙醇中配制而成。底物液（TMB：新鲜配制。TMB母液用底物缓冲液按1 : 20的比例稀释，每毫升底物 液加入0.2卩L 30% H2Q。5、终止液： 0.25% 氢氟酸（二,实验步骤1、 取已包被伪狂犬病毒抗原的酶标板（根据样品多少，可拆开分次使用, ，用样品稀释 液（PBS将待检样品1 : 40稀释

8、后加入板孔中，每孔加100卩l。同样1 : 40稀释阴、阳性 对照血清，阴、阳性对照各设2孔，每孔100卩l。另设一空白对照孔，空白对照孔加 100卩1 稀释液（PBS。轻轻振匀孔中样品（勿溢出），置37C温育20-30分钟。2、 洗板：甩掉板孔中的溶液，用洗涤液洗板3次，每次2-3分钟，200卩1/孑L,每次 在干净吸水纸上拍干。3、 每孔加酶标二抗（抗猪IgG-HRP结合物）100卩l，置37C温育20-30分钟。4、洗板：洗涤 3 次（方法同步骤 2）。5、 显色与终止：每孔加底物 A液、B液各1滴（50卩l），混匀。室温避光显色，10分钟后，每孔加终止液（0.25% 氢氟酸）1滴（50卩I），终止反应6、15分钟内测定结果。采用波长 630nm的酶标仪测定OD值。检测样本的OD值0.4为阳性。五、实验注意事项1、实验前血清样品必须置37C灭活30分钟2、在 ELISA 的整个操作过程中，洗涤是不可缺少的重要步骤，每加一层反应结 束后均要洗涤固相载体反应板，目的在于防止重叠引起非特异性吸附。洗涤过程中 的助溶剂吐温 20具有降低非特异吸附的作用。 洗涤时尽可能除去未结合的抗原及杂质， 用力甩干。3、 加入底物液后应该室温避光，结果判断须在 10分钟内完成。六、实验结果处理以空白孔调零，在酶标仪上测各孔 OD3。值。试验成立的条件是阳性对照孔平均OD30值大于或等于1.