酚氯仿法提取DNA主要步骤和原理

1、酚氯仿法提取DN蛀要步骤和原 理酚氯仿法提取 DNA 主要步骤：1. 将动物组织放在 1.5ml 的离心管中，分别用 75% 、50% 酒精和纯水梯度脱酒精。 每个梯度脱 水时间为 5-10min2. 将组织放入研钵中，加入适量DNA 裂解液（300a）,研磨后再加入300a IDNA裂解液冲洗 研磨棒。3. 将研磨好的组织液用移液枪加到1.5ml 离心管，在管中加10al蛋白酶K，用封口带将离心 管封口，放入摇床（56C,5h）。4. 加入等体积的 Tris饱和酚（500 a）,摇匀（ 10min）。5. 离心：12000R, 7min, 4C。离心后分成上中 下三层，上层为 DNA，中层为

2、蛋白质，下层为 有机质。6. 吸取上层液体加入新的离心管。7. 配制 Tris 饱和酚：氯仿：异戊醇 =25:24:1。8. 在含有上清液的离心管中加入Tris饱和酚、氯 仿和异戊醇混合液450 a，摇匀10min。9. 离心：12000R，7min, 4C。10. 吸取上清液加到新的离心管，加入等体积的氯仿和异戊醇混合液400a 1（氯仿：异戊醇=24:1）。11. 离心：12000R, 7min, 4C。12. 吸取上清液加入新的离心管， 加入 2.5 倍经过 -20 C冷冻的100%的酒精。-20 C过夜。13. 将样品取出，12000R, 7min, 4C离心。14. 弃上清，留白色沉

3、淀（DNA ），加400卩的75% 的经过-20C冷冻的酒精，反复吹打溶解。15. 重复第 14 步骤 2 次（用 75%酒精洗三次）。16. 提取 DNA 完成。溴氯仿法提取 DNA 的原理：用酚抽提细胞 DNA 时，有什么作用？使蛋白质变性，同时抑制了 DNase的降解作用。 用苯酚处理匀浆液时， 由于蛋白与 DNA 联结键 已断，蛋白分子表面又含有很多极性基团与苯酚 相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而 DNA 溶于水 相。使用酚的优点： 1. 有效变性蛋白质； 2. 抑制了 DNase的降解作用。缺点： 1. 能溶解 10-15%的水，从而溶解一部分 poly （A） RNA。 2. 不能完

4、全抑制 RNase 的活 性。氯仿的作用？氯仿：克服酚的缺点；加速有机相与液相分层。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的迹量酚。（酚 易溶于氯仿中）用酚氯仿抽提细胞基因组 DNA 时，通常要在 酚-氯仿中加少许异戊醇，为什么？ 异戊醇：减少蛋白质变性操作过程中产生的气 泡。异戊醇可以降低表面张力， 从而减少气泡产 生。另外，异戊醇有助于分相，使离心后的上层 含 DNA 的水相、中间的变性蛋白相及下层有机 溶剂相维持稳定。用乙醇沉淀 DNA 时，为什么加入单价的阳离 子？用乙醇沉淀 DNA 时，通常要在溶液中加入单价的阳离子，女口 NaCI或 NaAc, Na+中和 DNA 分子上的负电荷，减少

5、DNA 分子之间的同性电 荷相斥力，而易于聚集沉淀。原理：动物和植物组织的脱氧核糖核蛋白 （DNP） 可溶于水或浓盐溶液 （如 1moI/L 氯化钠），但在 0.14moI/L 氯化钠盐溶液中溶解度最低，而核酸 核蛋白（RNP）则在0.14moI/L氯化钠中溶解度 最大，利用这一性质可将其分开。将沉淀物溶解于生理盐水， 加入去污剂十二烷基 硫酸钠（SDS）溶液，使DNA与蛋白质分离开。 加入固体氯化钠使其浓度达到1mol/L，使DNA 溶解。加氯仿 -异戊醇去除蛋白质，也可重复该 步操作得较纯DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。 溶解：将离心后除去 RNA 的沉淀，用 30ml 生 理盐水溶解

6、，充分搅拌后，匀浆一次。加 4 毫升 10%SDS溶液，使溶液的SDS浓度达到1%左右， 边加边搅拌，放置60 C水浴保温10分钟（不停 搅拌），冷却。加固体氯化钠，使溶液氯化钠浓 度达到1mol/L，充分搅拌10分钟； 除杂质：加等体积氯仿 -异戊醇混合液，充分震 荡 10 分钟， 8000 r/min 离心 7 分钟，取上层液 量好体积，倒入烧杯中（离心管） ，加同体积的 氯仿 -异戊醇混合液，重复上次操作。直至界面 不出现蛋白凝胶为止； 沉淀：准确量取上清液体积，加 2 倍体积 95% 冷乙醇，搅拌后，置冰箱静止冷却，待有白色丝 状物出现，约10-15分钟，离心8000 r/min离心

7、7分钟，得白色沉淀； 溶解：将沉淀物用 0.1mol/L NaOH 约 10毫升溶 解,得 DNA 溶液。溶液 I 溶菌液： 溶菌酶：它是糖苷水解酶， 能 水解菌体细胞壁的主要化学成分肽聚糖中的3-1,4糖苷键，因而具有溶菌的作用。当溶液中 pH 小于 8 时，溶菌酶作用受到抑制。 葡萄糖： 增加溶液的粘度，维持渗透压，防止 DNA 受机 械剪切力作用而降解。 EDTA ：（ 1 ）螯合 Mg2 +、Ca2 +等金属离子，抑制脱氧核糖核酸酶对 DNA 的降解作用（ DNase 作用时需要一定的金 属离子作辅基） ;（2）EDTA 的存在，有利于溶 菌酶的作用， 因为溶菌酶的反应要求有较低的离

8、子强度的环境。溶液 II NaOH SDS 液：NaOH :核酸在 pH 大于 5，小于 9 的溶液中，是稳定的。但当 pH 12或pH3时，就会引起双链之间氢键的解 离而变性。 在溶液 II 中的 NaOH 浓度为 0.2mo1 /L,加抽提液时，该系统的pH就高达12.6, 因而促使染色体 DNA 与质粒 DNA 的变性。 SDS: SDS是离子型表面活性剂。它主要功能有： （1）溶解细胞膜上的脂质与蛋白，因而溶解膜 蛋白而破坏细胞膜。 （2）解聚细胞中的核蛋白。（3） SDS能与蛋白质结合成为 R-O-SO3-R + -蛋白质的复合物，使蛋白质变性而沉淀下来。 但是 SDS 能抑制核糖核

9、酸酶的作用，所以在以 后的提取过程中， 必须把它去除干净， 防止在下 一步操作中(用 RNase 去除 RNA 时)受到干扰。 溶液 lll-3mol / L NaAc (pH4.8)溶液：NaAc 的水溶液呈碱性，为了调节 pH 至 4.8，必须加 入大量的冰醋酸。所以该溶液实际上是 NaAc-HAc的缓冲液。用pH4.8的NaAc溶液是 为了把 pH12.6 的抽提液，调回 pH 至中性，使 变性的质粒 DNA 能够复性，并能稳定存在。而 高盐的3mol/L NaAc有利于变性的大分子染色 体DNA、RNA以及SDS-蛋白复合物凝聚而沉 淀之。前者是因为中和核酸上的电荷， 减少相斥 力而互

10、相聚合，后者是因为钠盐与SDS蛋白复 合物作用后， 能形成较小的钠盐形式复合物， 使 沉淀更完全。为什么用无水乙醇沉淀 DNA？ 用无水乙醇沉 淀DNA，这是实验中最常用的沉淀 DNA的方 法。乙醇的优点是可以任意比和水相混溶， 乙醇 与核酸不会起任何化学反应，对 DNA 很安全， 因此是理想的沉淀剂。 DNA 溶液是 DNA 以水 合状态稳定存在，当加入乙醇时，乙醇会夺去 DNA 周围的水分子，使 DNA 失水而易于聚合。 一般实验中，是加 2 倍体积的无水乙醇与 DNA 相混合，其乙醇的最终含量占 67左右。因而 也可改用 95乙醇来替代无水乙醇（因为无水 乙醇的价格远远比 95乙醇昂贵）

11、。但是加 95 的乙醇使总体积增大，而 DNA 在溶液中有一定 程度的溶解，因而 DNA 损失也增大，尤其用多 次乙醇沉淀时， 就会影响收得率。 折中的做法是 初次沉淀 DNA 时可用 95乙醇代替无水乙酵， 最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。也可以用 0.6 倍体积的异丙醇选择性沉淀 DNA 。一般在室温 下放置 1530 分钟即可。在用乙醇沉淀 DNA 时，为什么一定要加 NaAc 或NaCI至最终浓度达 0.10.25mol/L? 在pH 为 8 左右的溶液中， DNA 分子是带负电荷的， 加一定浓度的 NaAc或NaCI，使Na+中和DNA 分子上的负电荷，减少 DNA 分子之间的同性电

12、荷相斥力，易于互相聚合而形成 DNA 钠盐沉淀， 当加入的盐溶液浓度太低时，只有部分 DNA 形 成 DNA 钠盐而聚合，这样就造成 DNA 沉淀不 完全，当加入的盐溶液浓度太高时， 其效果也不 好。在沉淀的 DNA 中，由于过多的盐杂质存在， 影响 DNA 的酶切等反应，必须要进行洗涤或重 沉淀。加核糖核酸酶降解核糖核酸后，为什么再要用 SDS 与 KAc 来处理？ 加进去的 RNase 本身是 一种蛋白质，为了纯化 DNA ，又必须去除之， 加SDS可使它们成为SDS-蛋白复合物沉淀，再 加 KAc 使这些复合物转变为溶解度更小的钾盐 形式的SDS-蛋白质复合物，使沉淀更加完全。 也可用饱

13、和酚、氯仿抽提再沉淀，去除 RNase。 在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到 较好效果。7为什么在保存或抽提 DNA 过程中，一般采用 TE 缓冲液？ 在基因操作实验中， 选择缓冲液的 主要原则是考虑 DNA 的稳定性及缓冲液成分不 产生干扰作用。磷酸盐缓冲系统(pKa = 7.2)和 硼酸系统(pKa=9.24)等虽然也都符合细胞内环 境的生理范围(pH)，可作DNA的保存液，但在 转化实验时， 磷酸根离子的种类及数量将与 Ca2 产生 Ca3(PO4)2 沉淀；在 DNA 反应时，不同 的酶对辅助因子的种类及数量要求不同， 有的要 求高离子浓度，有的则要求低盐浓度，采用 Tri

14、s-HCI (pKa=8.0)的缓冲系统，由于缓冲液 是TrisH+/Tris，不存在金属离子的干扰作用， 故在提取或保存 DNA 时，大都采用 Tris-HCl 系统，而 TE 缓冲液中的 EDTA 更能稳 苯酚、氯仿、异戊醇在 DNA 提取时的作用 抽提 DNA 去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较 好？ 酚与氯仿是非极性分子， 水是极性分子， 当蛋白 水溶液与酚或氯仿混合时， 蛋白质分子之间的水 分子就被酚或氯仿挤去， 使蛋白失去水合状态而 变性。经过离心， 变性蛋白质的密度比水的密度 为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面，从而 与溶解在水相中的 DNA 分开。而酚与氯仿有机 溶剂比重更大，

15、 保留在最下层。 作为表面变性的 酚与氯仿，在去除蛋白质的作用中，各有利弊， 酚的变性作用大，但酚与水相有一定程度的互 溶，大约10%15%的水溶解在酚相中，因而 损失了这部分水相中的 DNA ，而氯仿的变性作 用不如酚效果好， 但氯仿与水不相混溶， 不会带 走 DNA 。所以在抽提过程中，混合使用酚与氯 仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残留 的酚，由于酚与氯仿是互溶的， 可用氯仿第二次 变性蛋白质， 此时一起将酚带走。 也可以在第二 次抽提时，将酚与氯仿混合（ 1:1）使用。 为什么用酚与氯仿抽提 DNA 时，还要加少量的异戊酵？在抽提 DNA 时，为了混合均匀，必须剧烈振荡 容器数次

16、， 这时在混合液内易产生气泡， 气泡会 阻止相互间的充分作用。 加入异戊醇能降低分子 表面张力，所以能减少抽提过程中的泡沫产生。 一般采用氯仿与异戊酵为 24：1 之比。也可采用 酚、氯仿与异戊醇之比为 25：24:1（不必先配制， 可在临用前把一份酚加一份 24：1 的氯仿与异戊 醇即成），同时异戊醇有助于分相，使离心后的 上层水相，中层变性蛋白相以及下层有机溶剂相 维持稳定。苯酚：氯仿：异戊醇为什么要 25:24:1？ 抽提 DNA 去除蛋白质时，怎样使用酚与氯仿较 好？酚与氯仿是非极性分子， 水是极性分子， 当 蛋白水溶液与酚或氯仿混合时， 蛋白质分子之间 的水分子就被酚或氯仿挤去， 使

17、蛋白失去水合状 态而变性。经过离心， 变性蛋白质的密度比水的 密度为大，因而与水相分离，沉淀在水相下面， 从而与溶解在水相中的 DNA 分开。而酚与氯仿 有机溶剂比重更大， 保留在最下层。 作为表面变 性的酚与氯仿， 在去除蛋白质的作用中， 各有利 弊，酚的变性作用大， 但酚与水相有一定程度的 互溶，大约10%15%的水溶解在酚相中，因 而损失了这部分水相中的 DNA ，而氯仿的变性 作用不如酚效果好， 但氯仿与水不相混溶， 不会 带走DNA。所以在抽提过程中，混合使用酚与 氯仿效果最好。经酚第一次抽提后的水相中有残 留的酚， 由于酚与氯仿是互溶的， 可用氯仿第二 次变性蛋白质， 此时一起将酚带走。 也可以在第 二次抽提