用毛细管电泳测定牦牛乳中的乳清酸含量

1、用毛细管电泳测定牦牛乳中的乳清酸含量牦牛( Bos grunniens )是青藏高原及毗邻高寒地区特有的 牛种，是当地牧民重要的生活资料与创造财富的生产资料， 也是 青藏高原畜牧业的主体。 牦牛乳的营养价值高于荷斯坦牛乳， 其 乳蛋白、脂肪、乳糖及干物质含量均高于其他牛种，是加工奶油 制品的最优原料之一。牦牛乳中蛋白质平均含量约为5.24%，明显高于普通牛乳( 3.40%)。此外，牦牛乳含有 18 种氨基酸，其 中包括 8 种必需氨基酸，总含量比普通牛乳高 15%：钙含量比普 通牛乳高 15%。目前对牦牛乳的研究主要涉及常规营养成分，而 对微量组分的研究较少。 进一步挖掘牦牛乳的优质特性， 对

2、于合 理开发利用牦牛乳资源具有实际价值， 也有利于青藏高原少数民 族地区的畜牧业发展。乳清酸( Orotic acid )是首先在牛奶中发现的核酸代谢物， 后又发现存在于各种哺乳动物的乳汁中及多种变异微生物的嘧 啶核苷酸的合成途径中。 有研究表明， 乳清酸会诱导脂肪肝的产 生，并且乳牛的某些遗传性疾病会表现为乳中的乳清酸累积， 因 此测定乳中乳清酸含量对鉴定乳的品质具有重要意义。 国内外现 采用多种方法测定乳清酸，常见的有高效液相色谱法(HPLC)、色谱一质谱联用法、 电化学分析法。 毛细管电泳技术是一种发展 十分迅速的色谱分离定量技术，具有快速、灵敏度高、进样量少 等优势，应用范围广。 有关

3、牦牛乳中乳清酸含量的分析尚未见报 道，本试验用毛细管电泳法对牦牛乳中的乳清酸的含量进行了测 定，以期为牦牛乳的品质分析提供方法。1 材料与方法1.1 样品的采集和处理 夏季采集四川省甘孜州昌台牦牛的乳样， 12 头处于泌乳中 期的昌台牦牛采用全天然放牧方式饲养， 于早晨手工挤奶。 全乳 经2000r/min离心20min，抽取下层脱脂乳，80C保存备用。本 试验还在超市中购买了两种品牌的液态全乳， 每种品牌中冷藏奶（26C贮存）和常温奶各选一种，处理方法同上。乳中的乳清酸参照 Saidi 等的方法提取待测。1.2 主要仪器与试剂P/ACEMD毛细管电泳仪（美国 Beckman公司）；Z323K

4、高速 冷冻离心机（德国 Hennle公司）；DELEA320pH计（瑞士 MettlerToledo 公司）：SB-5200DTD超声波清洗机（宁波新芝生 物科技 XX公司）：WPABiowave分光光度计（英国 Biochrom公 司）等。毛细管全长 57cm,有效长度50cm,内径75卩m运行 时柱温控制为25Co1.3 试验方法1.3.1 标准品的配制 准确称取乳清酸标准品（ Sigma 公司） 50mg加适量1mol/L的KOH助溶，加去离子水并用三氯乙酸调 节标准品溶液oH至2.75 （与样品oH相接近）后，加去离子水 定容到50mL用三氯乙酸调节去离子水 pH至2.75 ,用此酸水

5、将 标准品稀释为 7个浓度( 0.2-8.0mg/100mL )，用于制作标准曲 线。1.3.2分析条件试验所有毛细管柱为Beckman非涂层毛细 管(57cmx 50cm 75 卩 。运行缓冲液为 50mmol/LKH2PO与 50mmol/LNa2B4O7等体积混匀的硼酸一磷酸缓冲液，pH6.5,0.45卩m水性膜过滤，4C保存备用。参数设定：柱温25C，检测波长280nm毛细管柱在每次进样前分别用超纯水和 0.1mol/LNaOH冲洗10min,再用运行缓冲液冲洗 5min。更换样 品前，应在20Psi下用0.1mol/LNaOH冲洗5min。超纯水冲洗 5min，运行缓冲液冲洗10mi

6、n。进样时间为5s。0.5Psi。运行缓 冲液 20kV 洗脱 20min 后进行分离定量测定。1.3.3 加标回收率测定 向已知乳清酸含量的样品中加入相 同量的标准品，再测定乳清酸含量。根据公式计算回收率：加标 回收率=(加标试样测定值-试样测定值)/加标量x 100%1.3.4 精密度测定 重复 6次测定乳清酸标准品溶液(4mg/100ml)中乳清酸含量，以峰面积计算精密度。2 结果与分析2.1 毛细管电泳测定乳清酸方法的建立试验分析显示， 毛细管电泳测定乳清酸方法中， 运行缓冲液 的pH对样品的分离度有很大影响。如以pH5.5的磷酸一硼酸缓冲液为运行缓冲液时，分离峰有拖尾等现象。经多次优

7、化，确定 运行缓冲液为 50mmol/L 的磷酸一硼酸缓冲液， pH6.5。由图 1 可见，优化电泳条件后可获得较好的乳清酸电泳图谱，峰形对称、无拖尾现象。牦牛乳中乳清酸的保留时间为(15.9 0.6 ) min，商品液态奶乳清酸的保留时间为 (13.7 0.1 ) min，图2为某一牦牛乳中乳清酸毛细管电泳情况。在试验测定范围内， 乳清酸标准品浓度与峰面积呈良好的线性关系(图 3)，以峰面积计算精密度为 1.8%，最小检测值为0.02mg/100mL。试验测定的加标回收率平均值为(99.662.89) %。2.2 牦牛乳和商业奶中乳清酸含量本研究显示。昌台牦牛乳(n=12)中乳清酸平均含量为

8、(5.2 2.4 ) mg/100mL 范围在 2.2 9.9mg/100mL之间，个体 间含量差异较大。在商业奶中，两种冷藏奶平均含量为 8.2mg/100mL,两种常温奶平均含量为 6.6mg/100mL。冷藏奶中 的乳清酸含量均稍高于常温奶。 昌台牦牛乳中的乳清酸平均含量 均低于商业奶。3 讨论 乳清酸是哺乳动物从头合成尿苷及其衍生物的重要中间物。乳清酸可能是脂肪肝的化学诱导因素之一，但其机制还不确定。 乳清酸在乳中的含量并不高， 但患有亚临床乳腺炎的奶牛， 乳中 乳清酸含量显著增高。另外，患尿苷酸核酶缺乏症(DUMP)S 的奶牛，乳中有乳清酸累积现象。因此，检测乳中的乳清酸含量对 于监

9、测乳的品质和筛查奶牛是否患有DUMP具有实际意义。现普遍认为乳清酸可能会影响脂肪酸氧化， 促进脂肪合成， 减少脂肪 在肝中的运输。 人们日常饮食中乳清酸基本来自乳和乳制品， 乳 清酸的摄取量并不高，若另摄取一些乳清酸含量高的营养保健 品，则可能对人体产生负面影响。乳清酸含量的分析方法较多，常见的有色谱一质谱分析法、HPLC法、电化学分析法等。色谱一质谱法多用于测定尿液与血 浆中乳清酸含量，乳清酸与重氮结合后便于分离，适合GC/MS测定。该方法测定健康人尿中乳清酸含量与毛细管电泳法结果一 致，但分离测定方法上较为繁琐。HPLC法因具有灵敏度高、重现性好、操作简单等特点而应用广泛。Tonno等用H

10、PLC法测定乳制品中 11 种有机酸的含量，其中测定乳清酸含量的精密度为 1.85%，最小检测限为0.6mg/100mL。HPLC法测定不同物质需用 不同的色谱柱。 测定乳清酸含量用反相色谱柱， 而毛细管电泳法 只需要彻底清洗毛细管即可测定很多物质， 降低了测定成本。 王 福民等用极谱法测定了牛奶中乳清酸的含量，检测限为 0.015mg/100mL。此方法需25mL以上的样品，而毛细管电泳法可 实现微量测定。 牦牛乳中的乳清酸含量测定尚未见报道， 本研究 建立了毛细管电泳测定牦牛乳中乳清酸含量的方法，线性关系 好，检测限低(0.02mg/100mL)。适合于微量乳样中乳清酸的定 量。检测成本低、方法简便。可用于牦牛乳中乳清酸含量的大规 模监测。牛乳中代谢物含量受地理分布、饲料和遗传背景等的影响，这些因素可进一步影响乳的营养特性和加工工艺。 牦牛终年采食天然牧草，不使用饲料添加剂，是优质的乳资源。本研究测定牦牛乳中乳清酸平均含量