从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌

1、微生物学设计性实验报告 实验项目名称从壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌 成 员 专 业 班 级 指 导 教 师 从土壤中分离产淀粉酶的芽孢杆菌一、实验目的1、通过本实验的学习，学习掌握从环境中分离产淀粉酶菌株以及菌株初步鉴定的方法；2、巩固微生物分离纯化、细菌生理生化鉴定、染色观察等实验技能，对所学习过的微生物学实验方法进行综合技能训练；3、培养综合利用微生物学、生物化学等相关知识，自行设计、实施并判断实验结果的能力。4、要求根据所学知识自主设计实验方案，在实验方案通过审核后组织实施，最终要求获得产淀粉酶的菌株并对其进行初步的鉴定。二、实验材料 1、土壤样品 实验前一周在距土壤表层5-8厘米左右处填

2、埋馒头，实验前一天用塑料袋在预埋处取样 2、培养基 富集培养基,即16g的可溶性淀粉，蛋白胨5g， nacl 5g；选择性培养基，即可溶性淀粉 16克，蛋白胨5g，nacl 5克，琼脂20克，葡萄糖6克（培养及含量均为每升）。 3、试剂 草酸铵结晶紫染液，95%乙醇，番红水溶液、卢戈氏碘液 4、玻璃器皿烧杯（500ml）1锥形瓶（250ml）1培养皿18涂布棒1移液管（1ml）8盖玻片，载玻片若干试管10 5、其他设备及仪器 ph试纸，棉花，牛皮纸，玻璃珠，超净工作台、生化培养箱、电热干燥箱、高压蒸汽灭菌锅、水浴锅、显微镜、接种环等三、实验原理1、土壤中含有各种微生物，其中产淀粉酶的芽孢杆菌含

3、量在不同土壤中含量也不同，因此实验前进行预埋工作，能使土壤中产淀粉酶的细菌含量增加。待实验前取样即可。2、在只用淀粉充当碳源的选择培养基中，只有能产生淀粉酶利用淀粉的菌体能成为优势菌种。在淀粉选择培养基中，产淀粉酶的菌种可以得到富集及分离。3、芽孢是菌体生长到一定阶段形成的一种抗逆性很强的休眠体结构，芽孢最主要的特点就是抗性强，对高温、紫外线、干燥、电离辐射和很多有毒的化学物质都有很强的抗性。它帮助菌体度过不良环境，在适宜的条件下可以重新转变成为营养态细胞。细菌富集一段时间后，生长环境不利，会产生芽孢，再在80-90温度下杀死菌体，可使芽孢得到富集。4、菌体可经革兰氏染色后在显微镜下被判断出是

4、否为芽孢杆菌。5、在含有淀粉的鉴别培养基的平板上，具有产淀粉酶能力的芽孢杆菌，水解淀粉生成小分子糊精和葡萄糖，在淀粉平板上菌落周围出现水解圈，但肉眼不易分辨，滴加碘液，未水解的淀粉呈蓝色，水解圈无色。四、实验步骤1样本采集 在预埋处采取土样用塑料袋装好，不要损坏土壤的内部结构。2目的菌株的富集 取12.5g土壤加入250ml烧杯中，再加入112ml去离子水制成土壤混悬液，加入一小层玻璃珠。在锥形瓶中加入2g的可溶性淀粉，蛋白胨0.625g， nacl 0.625g，调节ph值为7.0-7.2。在37摄氏度摇床培养箱中培养两天，使菌体富集且产生大量芽孢。 在85-90水浴锅中加热10分钟，杀灭菌

5、体，使芽孢得到富集。3. 选择性分离 将菌液上清分别稀释成、，分别取菌液0.2ml均匀涂布在十个含葡萄糖的淀粉培养基上，在37摄氏度培养箱培养1天，平板培养基表面便形成了若干分散的单菌落。 4、制片检测 取其中平板培养基表面形成了若干分散的单菌落的平板，用卢戈氏碘液检测，根据有无淀粉水解圈来判断其有产淀粉酶能力，观察水解圈大小及菌落特征。 挑取对照板中菌落特征相同的菌落点，通过革兰氏染色制片观察，判别所选菌落是否为芽孢杆菌。5、 纯培养 取其中是芽孢杆菌的相应菌点种落接到淀粉平板上纯培养，在37摄氏度培养1天（每一种菌接点两处进行对照）。6、培养后观察各菌落形态特征 取其中一块板分别滴加鲁戈氏

6、碘液，观察淀粉水解圈大小，挑取对照板中的菌落通过简单染色制片观察，判别所选菌落是否为芽孢杆菌。7、 保藏菌种 在斜面淀粉培养基的试管上标上菌株名称和接种日期后进行接种，待菌种生长完全后，至于4左右的冰箱中保藏。5、 时间安排 6日上午：取样6日下午：富集培养，配制培养基并灭菌（另包括培养皿，移液管，试管等），倒平板，配制保藏菌种的培养基8日下午：杀死菌体，稀释菌液，接种芽孢9日下午：检测，染色制片观察，点种转接10日下午：检验所选菌种并保藏6、 实验结果 1、稀释后接种芽孢的平板上长出分散的单菌落，滴加碘液后有变色圈，其菌落特征为扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙有褶皱。 2、显微图片一株为杆状

7、，细长，中间或近似中间部位有芽孢，一株为球状，双生，均为革兰氏阳性。 此为的平板上的菌，24h后菌落直径为9mm，变色圈半径/菌落半径=1.43 此为的平板上的菌，菌落极小，无法观察形态,但是变圈很大3、 点种后的菌落形态扁平、边缘不整齐、白色、表面粗糙有褶皱，有水解圈，滴加碘液后有变色圈。 4、最终得到两株两株目的菌株。7、 分析或讨论 1、杀灭菌体时，温度控制不够好。温度应该是80-9010分钟，可当时我们是在70左右便把菌悬液放入到了水浴锅中，但是实际上，刚形成的芽孢总是处于休眠状态。热处理（如65放置几十分钟）可以使芽孢加速活化，提前放入水浴锅中可能使一部分芽孢刚刚萌发便被杀死，造成菌

8、悬液中的芽孢数量减少,或者，一部分芽孢直接被杀死。 2、接种时跳过的浓度，浓度选择不够合理。稀释菌悬液时，跳过的浓度，但是实验结果是，的平板上菌落太多，不能准确观察，的平板上菌落偏少，是最好的浓度。下次实验时应该注意在不能准确定接种的情况下应该多接种几组，不能怕麻烦。 3、培养基中加入葡萄量颇多，导致细菌利用较多利用葡萄糖，产生的淀粉水解圈不明显。培养基中加入葡萄糖，原因是芽孢萌发时加葡萄糖以利生长，但是可能是当时加入葡萄糖的量偏多，使不能利用淀粉的细菌芽孢也萌发，致使有较多杂菌不利于检验，同时又使可利用淀粉的细菌芽胞萌发成营养细胞后利用葡萄糖，而不是利用淀粉，致使产生的淀粉水解圈太小。下次实验时应注意仔细查阅资料及询问老师，控